基于Box-Behnken響應面設計法結合熵權法優選腦絡欣通方提取工藝

趙國棟，洪璐，王倪，何玲，張善堂，陳衛東*（.安徽中醫藥大學，合肥 300；.新安醫學教育部重點實驗室，合肥 30038；3.安徽省立醫院，合肥 3000）

腦絡欣通方（Naoluo Xintong decoction，NLXTD）是新安醫學用于中風治療的臨床驗方，由黃芪、川芎、三七等七味中藥按照君臣佐使理論配伍而成。全方活血寓于補氣之中，氣貫經脈以助血行，營血流暢經脈得養，臨床療效顯著?，F代藥理學研究表明腦絡欣通方治療缺血性中風療效顯著，在促進神經功能恢復，減小腦梗死體積，改善腦缺血再灌注損傷伴有的局部過度炎性反應等方面體現出顯著的治療優勢[1-3]。長期以來，腦絡欣通方應用于臨床多以湯劑的形式，其療效確切、易吸收、起效迅速[4]。但湯劑存在劑量不準確，藥效不穩定，服用量大，攜帶和運輸不便，不易保存等缺點，限制了其臨床應用和發展，故需要改進劑型。

響應面法（RSM）是一種綜合試驗設計和數學建模，通過對具有代表性的局部各點進行試驗，回歸擬合全局范圍內因素與結果間的函數關系，取得各因素最優水平值的優化方法；具有試驗次數少、精密度高、模型預測性能好、可用于研究幾種因素間交互作用等優點[5]。熵權法（EWM）則是經過對試驗獲得的數據進行整理，計算和分析，進而得出各項試驗指標的權重系數[6]。采用兩者結合的方式優化中藥提取工藝，既可以系統地對影響中藥提取工藝的各因素及因素間相互作用進行研究，又有利于降低人為主觀因素造成的試驗結果偏差，使試驗結果更具有科學性和合理性。

基于此，為更好地進行腦絡欣通方的新藥開發工作，本研究依據中藥新藥研發的相關要求，結合生產實際，采用Box-Behnken 響應面設計法，選擇腦絡欣通方提取液中3 種成分（羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸）的含量及復方出膏率作為考察指標，運用熵權法對試驗結果進行綜合評價，旨在優選出腦絡欣通方提取工藝的最佳工藝參數，為其劑型改進提供試驗依據，并為該方進一步的研究與開發提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20ADXR 液相色譜儀（日本島津儀器有限公司）；電子天平（型號：PA1004B，上海越平科學儀器有限公司）；數顯恒溫水浴鍋（型號：WB-2000，鄭州長城科工貿有限公司）；數控超聲波清洗器（型號：KQ2200，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；CP2250 分析天平（精度：0.01 mg，奧豪斯國際貿易有限公司）。

1.2 試藥

羥基紅花黃色素A（批號：R25A9F 59977）、毛蕊異黃酮苷（批號：Y27F9H 54731）（對照品，質量分數≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；阿魏酸對照品（批號：110773-201614，質量分數≥98%，中國食品藥品檢驗研究院）；液相用乙腈為色譜純，水為超純水，其他化學試劑均為分析純。黃芪（批號：200601）、紅花（批號：200601）、三七（批號：200601）、川芎（批號：200601）、天麻（批號：200601）、當歸（批號：200601）（安徽友信藥業有限公司），蜈蚣（批號：160801，安徽亳州廣印堂中藥有限責任公司），均經安徽中醫藥大學俞年軍教授鑒定其為正品。

2 方法與結果

2.1 樣品溶液的制備[7]

2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密稱定羥基紅花黃色素A 2.38 mg、毛蕊異黃酮苷1.00 mg、阿魏酸1.00 mg 對照品置于5 mL 量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，制成含羥基紅花黃色素A 476.00 μg·mL－1、毛蕊異黃酮苷200.00 μg·mL－1、阿魏酸200.00 μg·mL－1的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 按照腦絡欣通方藥材比例稱取藥材40 g（黃芪∶川芎∶三七∶天麻∶當歸∶紅花∶蜈蚣＝15∶5∶3∶5∶5∶5∶2），精密稱定，將除蜈蚣以外的其余藥材全部置于圓底燒瓶中，精密加入8 倍量超純水浸泡30 min，回流提取1 h，趁熱用紗布過濾，得到藥渣與煎出液，重復一次，合并提取液；將蜈蚣研磨成粉狀物加入提取液中，將混勻的提取液低速離心（3000 r·min－1，10 min），取上清液經布氏漏斗抽濾得濾液，棄去濾渣，再用旋轉蒸發儀濃縮至1 mL 含生藥0.5 g；精密量取4 mL 濃縮液加入6 mL 無水乙醇，靜置沉淀24 h，取上清液1 mL 用5%的乙腈稀釋2 倍，過0.22 μm 濾膜，即得供試品溶液。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備 按處方配比，分別稱取除紅花以外、除黃芪以外以及除川芎、當歸以外的其他藥材，按制備工藝制成復方水提液，再按“2.1.2”項下方法制得陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Unitary C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30℃；流速：0.8 mL·min－1；檢測波長：230 nm；流動相：乙腈（A）-0.05%的磷酸水（B）；梯度洗脫程序：0～18 min，5%～17%A；18～28 min，17%～20%A；28～40 min，20%～25%A；40～45 min，25%～90%A；45～55 min，90%A；55～60 min，90%～5%A。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性及系統適應性考察 分別吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液20 μL，按“2.2”項下色譜條件進樣分析，結果表明，羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮苷及阿魏酸均能與其他組分達到基線分離，各吸收峰的理論塔板數均不低于5000，且陰性樣品溶液無干擾（見圖1）。

圖1 混合對照品（A）、供試品（B）、缺紅花陰性樣品（C）、缺黃芪陰性樣品（D）及缺川芎、當歸陰性樣品（E）的HPLC 圖Fig 1 HPLC of mixed reference substance（A），sample（B），negative sample without Carthami Flos（C），negative sample without Astragali Radix（D），and negative sample without ChuanXiong Rhizoma and Angelicae Sinensis Radix（E）

2.3.2 線性關系考察 以“2.1.1”項下混合對照品溶液作為母液，進行倍比稀釋，制成一系列質量濃度的混合對照品溶液。按照“2.2”項下色譜條件進樣分析，測定峰面積，以對照品質量濃度為橫坐標（X），相應的峰面積積分值為縱坐標（Y），繪制標準曲線，計算回歸方程。羥基紅花黃色素A：Y＝1.28×104X＋1.84×105，r＝0.9998；毛蕊異黃酮苷：Y＝3.84×104X－1.10×105，r＝0.9999； 阿魏酸Y＝3.79×104X－2.59×105，r＝0.9999；羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮苷、阿魏酸在46.648～466.480 μg·mL－1、19.600～196.000 μg·mL－1、19.600～196.000 μg·mL－1與峰面積呈良好線性關系。

2.3.3 精密度考察 精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液10 μL，連續進樣6 次，計算羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮苷、阿魏酸峰面積RSD分別為0.67%、0.08%、0.06%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液6 份，分別放置0、2、4、6、8、12 h 進樣。計算羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮苷、阿魏酸峰面積RSD分別為1.2%、1.4%、2.0%，結果表明供試品溶液在12 h 內穩定。

2.3.5 重復性試驗 選取同一批藥材，按腦絡欣通方藥材比例稱取藥材40 g，精密稱取6 份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，記錄羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮苷、阿魏酸的色譜峰面積，RSD值分別為1.5%、1.8%、1.9%，表明該方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收試驗 取已測定的同一批藥材，按腦絡欣通方中藥材的比例精密稱取藥材40 g，共6 份，按“2.1.2”項下方法制備提取液，分別精密加入一定量的混合對照品溶液，制得供試品溶液，按照“2.2”項下色譜條件進樣測定，羥基紅花黃色素A 平均回收率為99.4%，RSD為1.3%；毛蕊異黃酮苷的平均回收率為100.1%，RSD為1.5%；阿魏酸的平均回收率為100.3%，RSD為1.3%，說明該方法回收率良好。

2.4 出膏率測定

精密量取供試品溶液40 mL，置干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，于真空干燥箱中烘干至恒重，取出，移置干燥器中，冷卻，迅速稱重，計算出膏率。

2.5 單因素試驗

按照腦絡欣通方藥材比例稱取藥材40 g，加入10 倍量的超純水，考察不同浸泡時間（20、30、40、50、60 min），提取時間（30、60、90、120 min），提取次數（1、2、3、4 次），對腦絡欣通方中羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮苷、阿魏酸的含量及浸膏得率的影響。結果表明：各項指標的高低受浸泡時間、提取時間及提取次數影響顯著，直觀分析確定浸泡時間最優值在40～60 min 內，最優提取時間在60～120 min 內，最優提取次數在2～4 次內，故選三因素三水平進行響應面優化設計。

2.6 Box-Behnken 響應面法優化提取工藝

2.6.1 Box-Behnken 響應面法試驗設計及試驗結果 選擇水為提取溶劑，以提取時間（x1）、提取次數（x2）、浸泡時間（x3）為考察因素，羥基紅花黃色素A 含量（y1）、毛蕊異黃酮苷含量（y2）、阿魏酸含量（y3）及出膏率（y4）為評價指標，采用Box-Behnken 響應面法優化提取工藝。試驗設計及結果見表1。

表1 響應面試驗設計方案及結果Tab 1 Response surface test design

2.6.2 信息熵法對數據的分析[8]信息熵是系統不確定性和無序程度的度量，除了度量數據包含的信息量，還可在多指標評價系統中用于確定各指標權重。該法是將每個評價指標作為一個隨機變量，計算該指標的熵權系數，其取值變異程度越大，越無序，提供的信息量越多，該指標就越重要；反之該指標就越不重要。用熵權法確定權重的計算步驟如下：

① 指標歸一化處理：設m個評價指標n個評價對象的原始數據矩陣為X＝（aij）mn，對其歸一化后得到X’＝（xij）mn，對正向指標而言，按照以下公式進行歸一化。

X’ij＝（aij－min j {aij}）/（max j {aij}－min j {aij}），X’ij表示第i次試驗時第j個評價指標的取值，i＝1，2，3，…，m；j＝1，2，3，…，n。

② 將原始數據陣（aij）mn轉換為概率矩陣（Pij）mn；在信息熵公式中Pi為某個信息的概率，滿足0 ≤Pi≤1，因此必須先對矩陣（aij）mn進行歸一化處理，經處理后的矩陣可視為評價指標的概率矩陣。其中Pij表示第j次試驗在第i個評價指標下的概率。

③ 計算指標的熵值，確定第i個評價指標的信息熵（Hi）。

④ 計算指標的熵權系數（Wj）。

運用Design-Expert 10 軟件對表2中的數據進行二次多元回歸擬合分析，得到提取時間（x1）、提取次數（x2）、浸泡時間（x3）與綜合評分（Y）之間的二次多元回歸模型方程：

表2 各指標熵值及權重系數Tab 2 Entropy value and weight coefficient of each index

Y＝0.33 － 0.061x1－ 0.061x2＋0.08x3＋0.12x1x2－ 0.17x1x3－ 0.19x2x3＋0.064x12＋0.089x22－3.750×10－3x32

對綜合評分值模型進行方差分析，結果方程決定系數r2＝0.9502，表明該回歸模型的擬合情況良好。由二次回歸模型方差分析結果（見表3）可知，該模型具有高度顯著性，可信度高，失擬項不顯著，說明該模型擬合度較好，可以對不同條件下的目標指標進行預測。

表3 方差分析結果Tab 3 Variance analysis

2.6.3 響應面優化提取工藝 根據擬合的二次回歸模型，采用Design-Expert 10 軟件繪制綜合評分值隨因素變化的三維曲面圖和等高線圖，如圖2所示。圖2A 顯示浸泡時間為50 min 的條件下，提取時間和提取次數對綜合評分值的影響，提取時間的最優區域是60～120 min，提取次數的最優區域是2～4 次。圖2B 顯示提取時間為90 min的條件下，浸泡時間和提取次數對綜合評分的影響，浸泡時間的最優區域是40～60 min，提取次數的最優區域是2～4 次。圖2C 顯示提取次數為3 次的條件下，浸泡時間和提取時間對綜合評分值的影響，浸泡時間的最優區域是30～50 min，提取時間的最優區域是60～120 min。

圖2 不同因素對綜合評分值影響的等高線圖與響應面圖Fig 2 Contour map and response surface map of influence of different factors on the comprehensive scores

2.6.4 驗證試驗 結合二次回歸方程，求解得到最佳工藝條件為提取74.53 min，浸泡59.94 min，提取2.20 次（綜合評分預測值0.850）?？紤]到實際工藝生產，求得的最佳工藝條件均取整數，即提取74 min，浸泡60 min，提取2 次。在該工藝下平行試驗3 次，測定指標成分含量和出膏率。實測綜合評分值分別是0.824、0.870、0.815，與預測值之間的RSD均小于3%，證明該工藝穩定可靠。

3 討論

以往的復方提取工藝研究，較多是對料液比、提取時間及提取次數進行考察。在預試驗中選擇8 倍、10 倍、12 倍的料液比在其他因素相同的條件下分別提取。結果顯示，3 組所得樣品的指標成分含量及出膏率并沒有體現出顯著差異?？紤]到腦絡欣通方中有效成分大多為親水性成分，如羥基紅花黃色素A，相較于料液比，浸泡時間產生的影響往往更大。因此，本試驗選擇浸泡時間、提取時間及提取次數作為考察因素。

在考察指標的選擇中，考慮到毛蕊異黃酮苷是黃芪改善缺血性腦卒中的重要活性成分[9-10]，具有促進血管新生，增加缺血再灌注大鼠腦細胞中膜的流動性等作用。阿魏酸為當歸和川芎的指標成分[11]，具有抗血小板聚集、解除血管平滑肌痙攣、抗氧化和清除氧自由基、提高膜穩定性等藥理作用[12]。羥基紅花黃色素A 是紅花中的主要活性成分，具有活血、化瘀、通脈的功效，能夠有效治療缺血性腦卒中[13]。此外，在高效液相色譜圖中也能直觀發現羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮苷及阿魏酸具有相對較高的峰面積，色譜峰易于辨識。浸膏作為中藥藥效的物質基礎，出膏率的變化往往影響有效成分的含量變化，從而影響中藥復方的藥效。綜上，本試驗選取羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮苷、阿魏酸3 個活性成分含量以及出膏率作為考察指標。

除考察指標的選擇外，各項指標的權重系數同樣影響著試驗結果的可靠性。依據個人經驗主觀賦權往往會導致試驗結果出現偏差，缺乏科學性與合理性。本試驗基于熵權法計算各項指標的綜合權重，結果更具有穩定性和可靠性，能夠為腦絡欣通方提取工藝研究提供參考。