細胞外基質在糖尿病足潰瘍防治研究中的應用進展

王軒宇，闕華發（1.上海中醫藥大學，上海 200032；2.上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 200032）

據報道，全世界約有4.15 億人患有糖尿病，另約有1.93 億潛在糖尿病患者未被診斷[1]。我國成人糖尿病患者人數已超過1.14 億[2]。糖尿病足潰瘍（diabetic foot ulcer，DFU）是一種嚴重的糖尿病并發癥，糖尿病患者終生患腳潰瘍的風險高達25%[3]。DFU 患者截肢率和死亡率高，死亡率約為未患有DFU 的糖尿病患者的兩倍[4]。DFU 復發率高，3年后復發率大于50%[5]。糖尿病患者因局部缺血、神經病變、感染等因素協同作用而導致足潰瘍發生。此外，年齡、性別、吸煙史、足部溫度等因素也影響DFU 的發生發展[6-8]。目前，DFU的外治主要以局部清創和新型敷料為主，但由于其發病機制尚不明確，臨床治療缺乏靶向性，因此DFU 仍然是慢性難愈性潰瘍領域的重大挑戰。

細胞外基質（extracellular matrix，ECM）是由膠原蛋白、蛋白聚糖/糖胺聚糖、彈性蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白和其他糖蛋白組成的非細胞三維高分子網絡[9]。既往的研究中，人們常注重探究細胞內環境和成分的改變對疾病的影響，而ECM 對疾病的影響不夠重視。隨著細胞分離技術和分子生物學的進步，人們逐漸認識到ECM 不僅是支持細胞的框架，還提供重要的生物化學與生物物理學信息，對細胞形態、生長、分裂、分化和凋亡起重要的調控作用。當前，ECM 已證實與免疫、炎癥、創面愈合、血管生成、惡性轉化等密切相關[10]。近年來，國內外研究發現ECM 在DFU 的發生、發展及轉歸中起到了重要作用。本文對一些主要ECM 組分及其相關酶類與抑制劑在DFU 的發生與修復中的作用與可能機制進行重點綜述。

1 ECM 穩態在DFU 創面愈合中的作用

ECM 是一種高度動態的結構網絡，其蛋白組分與相關酶類以及酶類相關抑制劑的組成、含量、形態結構以及生物活性共同構成ECM 穩態，是細胞微環境的重要組成部分。維持ECM 穩態無論是在組織發育還是在組織的疾病與再生中都至關重要，因而越來越受到重視。DFU 創面愈合既涉及細胞遷移、增殖與分化，也涉及ECM 沉積和重塑等生物學過程。在DFU 微環境中，深入探究ECM 穩態重塑在DFU 傷口愈合的作用與機制可為以ECM為分子靶標的DFU 治療策略提供新的研究方向。

DFU 進展特征區別于普通創面愈合過程，表現為炎癥期延長，增殖期有限，重塑不規則等[11-13]。ECM 作為結構支撐和細胞相互作用的重要媒介，是創面愈合的關鍵促進者。在傷口愈合過程中，斷裂的原纖維被ECM 酶降解，如基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），包括膠原酶和明膠酶等，新的ECM 原纖維也被合成和修飾來實現肌肉等組織再生[14-15]。即ECM 重構涉及ECM 退化、產生和成熟之間的平衡，以及MMPs 和金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）的平衡。而在DFU 傷口愈合過程中，涉及的炎癥因子、活性氧（reactive oxygen species，ROS）等過度分泌以及ECM 調控基因、ECM 相關酶類異常表達，平衡傾向于產生更多降解的、不可溶性的原纖維，導致ECM 穩態紊亂。DFU 中主要ECM及其相關酶類的變化情況見表1及表2。

表1 DFU 進程中主要ECM 分子的變化情況Tab 1 Change of major ECM components in the DFU process

表2 DFU 進程中ECM 相關酶類及其抑制劑的變化情況Tab 2 Change of ECM related enzymes and their inhibitors in the DFU process

在糖尿病中，高糖環境和其他變化引起炎癥因子過度釋放及氧化應激性損傷，MMPs 的產生增加，高表達的MMPs 進一步加重炎癥，同時MMPs/TIMPs 比值增加，導致ECM 穩態改變，ECM 片段過度累積[27-28]。此外，高糖導致糖基化引起晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）的蓄積也會改變ECM 的結構和功能，糖基化導致分子間交聯的形成，這顯著改變了ECM 的生物力學特性，并導致真皮成纖維細胞的細胞周期停滯和凋亡[29-31]。而ECM 的病理狀態，進一步影響細胞黏附與增殖及細胞正常生物功能，導致DFU 創面經久難愈。ECM 穩態在DFU 中的作用模式見圖1。

圖1 ECM 穩態在DFU 進程中的作用模式示意圖Fig 1 Mode of ECM steady state in the DFU process

2 ECM 及其酶類在DFU 治療中的作用

2.1 ECM 在DFU 治療中的作用

透明質酸（hyaluronan，HA）是皮膚ECM的主要成分，以酯化的形式存在于許多真皮基質中。HA 在創面愈合的增殖階段影響細胞的遷移、增殖、炎癥反應和血管生成等多種過程，在傷口愈合和組織修復過程中處于關鍵地位[32]。Lee等[33]為了確認HA 在DFU 治療中的唯一有效性，使用不含其他物質的HA 敷料進行了一項前瞻性研究，將34 位患者隨機分為HA 敷料組和常規敷料組兩組，發現HA 敷料組的完全治愈率顯著高于常規敷料組，潰瘍愈合速度更快。這些研究顯示，HA 作為ECM 的主要成分，純外源性HA 敷料治療DFU 有效。

膠原蛋白（collagen）是一種主要ECM 組分，也是皮膚的重要組成部分，可促進成肌纖維細胞分化與纖維化，從而保留天然ECM 結構并促進愈合[34]。Colak 等[35]將64 例Wagner 2 級或以上DFU 患者分為膠原組（34 例）和生理血清組（30例），治療12周后，生理血清組17例患者（56.6%）完全愈合，膠原組25 例完全愈合（73.5%）。與生理血清組相比，膠原蛋白組平均愈合時間更短、創面愈合率明顯更高，提示在DFU 的治療中使用膠原蛋白敷料可以有效縮短愈合時間。

2.2 以ECM 酶類為靶點的DFU 防治

MMP-9 等酶高表達及MMPs/TIMPs 比例失衡是導致DFU 創面難愈的主要原因，以MMPs為靶標設計抑制劑有望成為DFU 防治新策略。ND-336 能選擇性抑制MMP-9，同時不影響MMP-8 活性，可通過降低炎癥，增強血管生成和使傷口重新上皮化來加速糖尿病傷口的愈合，從而逆轉病理狀態，有效促進DFU 創面愈合[36]。ND-336 和活性重組MMP-8 復合物的局部應用進一步增強了愈合效果，這一策略在DFU 的愈合中具有很大的前景[37]。

高選擇性MMP 抑制劑已被證實在DFU 的治療中具有巨大潛力。然而，MMPs 之間結構的相似性使得選擇性MMPs 抑制劑的藥物設計極具挑戰。隨著多組學及生物信息學技術進步，應用于靶標和藥物間關聯網絡藥理學的構建，結合分子對接技術進行高精度預測，可為尋找高特異性的MMPs 抑制劑提供解決方案。

3 ECM 穩態在DFU 創面愈合中可能的機制

ECM 通過連接特定的跨膜受體，激活或改變細胞形態和細胞骨架動力學特性，影響細胞內信號傳導，從而調節細胞的生長、遷移和細胞命運，介導多種生理和病理過程。傷口愈合是一個復雜的生物學過程，涉及復雜的ECM 分子和細胞間的相互作用。目前，缺乏DFU 的發病機制制約了人們對ECM 在DFU 創傷愈合中的理解，現有研究主要集中在ECM 組分及其酶類變化導致DFU創面難愈，以及ECM 相關成分防治DFU 有效性與安全性的評價，而關于ECM 分子在DFU 的作用機制缺乏深入研究，本文綜合當前的研究結果，將ECM 穩態在DFU 中可能的機制進行以下探討。

3.1 新生血管生成

血管生成在傷口愈合中起核心作用，新生血管生成機制受損是DFU 傷口難以愈合的主要因素。ECM 包括基質蛋白及其降解性金屬蛋白酶，是微環境的主要組成部分，在血管重塑過程中表現出復雜的動態變化[38]。基底膜（BM）是ECM中的細膩、納米級和柔軟的薄片，它直接影響皮膚完整性和神經肌肉結構，從而影響皮膚脂肪形成和纖維化[39]。BM 是支撐毛細血管形態結構和維持血管動態平衡所必需的物質。通過去除包含生長因子的細胞成分和脂質殘留物純化獲得的無細胞脂肪提取物（cell-free fat extract，Ceffe），能顯著促進體外培養的真皮成纖維細胞的增殖。在小鼠皮膚中，Ceffe 顯著增加了真皮的厚度、增殖細胞的數量和毛細血管的密度[40]。骨ECM-仿生納米纖維系統顯著改善了內皮細胞的附著和增殖，并上調血管生成標記（CD31）的表達，其在體內還通過上調低氧誘導因子-1α（Hif-1α），血管內皮生長因子（VEGF），膠原蛋白1（Col1）和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的mRNA 和蛋白表達，顯著促進了血管生成、肉芽組織形成以及膠原基質重塑和表皮分化，從而有效促進糖尿病傷口的愈合[41]?？梢?，DFU 組織內ECM 合成與降解的失衡影響血管生成和毛細血管完整性可能是導致創面難愈的主要原因，外源性ECM 對DFU 新生血管形成有積極意義。

3.2 氧化應激水平

氧化還原信號通過影響ECM 的結構與功能調節傷口愈合。糖尿病中正常的氧化還原信號被破壞，導致自由基（如ROS）生成和清除之間關系失衡。研究發現DFU 患者的病灶周圍皮膚組織處于嚴重的氧化應激狀態，皮膚核因子-E2 相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，NRF2）介導的抗氧化反應活性降低，氧化性DNA 損傷增加[42]。臨床標本檢測結果表明，與對照組相比，DFU 組組織中過氧化氫酶（catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性降低，丙二醛（malondialdehyde，MDA）和一氧化氮（NO）含量增加，高糖水平可能通過激活PKCβ-p66shc 途徑誘導細胞和組織氧化應激損傷[43]。

3.3 細胞行為與功能

骨髓來源的內皮祖細胞（EPCs）募集減少，成纖維細胞和角質形成細胞的增殖和遷移降低是DFU 愈合不良的主要特征。ECM 對這些細胞的功能與行為產生重要影響。ECM 連接特定的跨膜受體，激活改變細胞形狀和細胞骨架動力學的細胞內信號傳導，從而調節細胞的生長和活力、細胞遷移，對塑造發育和協調組織行為至關重要。體外研究表明纖連蛋白能保持EPCs 干細胞特征并擴增，而明膠和膠原蛋白則將EPCs 導向成熟的內皮表型，這些ECM 可通過調節EPC 為骨髓重建和新血管生成提供條件[44]。外源性膠原蛋白膜能促進成纖維細胞遷移[45]。HA 由成纖維細胞與角質形成細胞動態產生，細胞外HA 與細胞表面受體CD44 的相互作用在這些細胞生理中起重要調節作用[46]。可見，DFU 環境下的ECM 組成和結構的紊亂損害了細胞行為與功能，引起損傷局部組織穩態失衡，最終造成愈合困難。

3.4 炎性細胞因子水平

糖尿病患者體內長期高血糖發揮累積作用，導致感染后炎癥細胞因子水平升高，細胞毒性介質分泌增加，從而導致持續的炎癥狀態和傷口上皮功能異常[47]。DFU 創面組織MMPs 分泌增加，其水解產物ECM 片段增多。而大量ECM 片段及其受體與體內炎癥發生顯著有關[48]。此外，在炎癥過程中ECM 片段表達上也可以激活免疫細胞，從而使炎癥反應持續發生[49]。這種異常表達的ECM 與炎癥反應之間相互影響、相互促進作用模式導致DFU 創面長期在較高的炎癥水平，以致遷延難愈。

3.5 生長因子水平

生長因子是一類生物活性多肽，包括血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）、轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）等，影響多種細胞的增殖和遷移，成纖維細胞和炎癥細胞的血管生成和趨化，在加速和促進傷口愈合過程中起著重要作用，生長因子也有助于防止細胞凋亡，并影響ECM 的產生和重塑[50]。糖尿病患者VEGF-A 和胎盤生長因子（PlGF）等生長因子表達水平與DFU的發生成負相關[51]。ECM 有利于維持生長因子活性，DFU 創面組織ECM 穩態遭到破壞，導致生長因子受體的調節降低和生長因子的快速退化，從而影響患者傷口愈合。

4 問題與展望

長期以來，人們普遍傾向于將ECM 簡單視為一種結構組分，將機體重要病理生理改變解釋歸于單純的細胞功能與活動的變化。隨著對ECM的機械性能與生物力學研究的逐漸深入，以及對整聯蛋白、CD44、盤狀蛋白結構域受體等細胞表面受體的廣泛研究，人們對其與細胞之間的復雜相互作用逐漸有了清晰認識，明確了ECM 組分調節信號級聯與細胞骨架構型等功能在細胞形態發生和穩態維持等方面的重要性，強調了其在急慢性創面愈合中的關鍵作用。靶向ECM 組件（例如蛋白聚糖和糖胺聚糖，MMPs 和TIMPs 等）有望成為慢性難愈性創面修復創新防治的新策略。

目前，DFU 的治療主要有傷口清創，減壓，重塑血管和防治感染等方法。除這些傳統療法外，新的治療方法如重組生長因子，皮膚替代品，細胞因子刺激物或抑制劑，MMPs 抑制劑，神經肽，血管生成刺激物等[52]，以及未來的治療策略包括干細胞的療法，基因療法，應用血管緊張素受體類似物等已成為DFU 防治研究的熱點。這些新型DFU 的治療方法中，通過干預生長因子、炎性因子、MMPs、血管生成以及干細胞等療法需要通過調節ECM 組件或ECM 功能支持來實現。提示，ECM 組件在DFU 的傳統或新型療法中都起著舉足輕重的作用，以ECM 為靶點的DFU 防治研究具有重要學術意義與應用價值。

然而，目前掌握的有關蛋白酶和生物活性ECM 片段數據是有限，另外蛋白酶和ECM 片段通常存在時間短，且局部濃度低，因此，尚缺乏對ECM 完整的生物學信息的了解[53-54]。此外，ECM 的特定受體、ECM-受體間相互作用機制研究均不夠充分，ECM 穩態失衡引起細胞外微環境的改變是如何調控細胞的生長，代謝，遷移，增殖和分化等生命活動，以及調節組織或器官的功能機制尚未闡明。因此，缺乏對ECM 完整的生物學信息的了解，局限了ECM 對DFU 作用及其機制的詮釋。隨著先進檢測與分析技術的快速進步，如基于定量蛋白質組學、轉錄物組學、表觀遺傳學等方法，通過組織質譜、雙光子顯微鏡和低溫電子顯微鏡，以及基于衍射和X 射線的光譜技術，能準確而有效地分析低豐度物質的時空分布，有助于系統地詮釋ECM 功能與活動，以及細胞-ECM 間復雜的生物學作用。這些方法可以應用于ECM 在DFU 中作用與機制研究，為開發更有效的DFU 防治策略提供新的思路與方向。