黃芩UPLC-DAD指紋圖譜的建立及其黃芩苷和漢黃芩苷的含量研究

鄭如文，劉港輝，江志強，董玉君，張俊華，程國華*（.廣州白云山光華制藥股份有限公司，廣州508；.暨南大學藥學院，廣州 5063）

黃芩是唇形科黃芩屬多年生草本植物，干燥根為藥用部位，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎的功效[1]，可用于肺熱咳嗽、胎動不安等癥。黃芩中活性成分以黃酮類化合物為主，包括野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素 A 等，其中黃芩苷是評價黃芩藥材質(zhì)量的主要依據(jù)[2-3]。《中國藥典》2020年版一部中收載了HPLC 法測定黃芩苷成分的含量標準[4]，但未見其他黃酮類成分及指紋圖譜的檢測標準。中藥指紋圖譜作為鑒定和評價中藥質(zhì)量的重要技術(shù)，已經(jīng)成為國內(nèi)外中藥材和天然藥物質(zhì)量控制的常用方法[5-7]。

超高效液相色譜技術(shù)（UPLC）能夠快速地分析和鑒定藥材中的化學成分，具有高分辨率的特點[8-9]。本研究采用UPLC 和優(yōu)化的超聲提取方法[10-12]，同時測定黃芩苷和漢黃芩苷成分的含量并建立相應(yīng)的指紋圖譜，為黃芩藥材的質(zhì)量評價方法提供參考。

1 材料

1.1 儀器與試藥

UPLC-DAD（Agilent Infinity 1290Ⅱ）；KQ-500VDB 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XPE26 型百萬分之一天平、ML204T型萬分之一天平（美國梅特勒公司）；BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters）；黃芩苷（批號：110715-201821，純度：95.4%）、漢黃芩苷（批號：112002-201702，純度：98.5%）、野黃芩苷（批號：110842-201709，供含量測定用）、黃芩素（批號：111595-201808，供含量測定用）、漢黃芩素（批號：111514-201706，供含量測定用）對照品（中國食品藥品檢定研究院），千層紙素A對照品（批號：Y31M9H62597，供含量測定用，源葉生物）；甲酸（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；乙腈（色譜純，德國默克公司）；甲醇（分析純，廣州化學試劑廠）。

1.2 樣品

共采集5 個產(chǎn)地不同生長年限的26 批黃芩干燥根，經(jīng)暨南大學藥學院中藥教研室張英副教授鑒定均為唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）。來源見表1。

表1 不同產(chǎn)地黃芩干燥根的來源Tab 1 Sources of dried roots of Scutellaria baicalensis Georgi from different origins

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫14 min（見表2），后運行5 min；檢測波長280 nm；流速0.4 mL·min－1；柱溫40 ℃；進樣量2 μL。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution

2.2 指紋圖譜共有峰的確定

將樣品的色譜數(shù)據(jù)導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”，系統(tǒng)生成黃芩藥材的對照指紋圖譜（見圖1）。通過對照品明確黃芩藥材的6 個特征峰（見圖2），分別為野黃芩苷（1）、黃芩苷（2）、漢黃芩苷（3）、黃芩素（4）、漢黃芩素（5）和千層紙素A（6），保留時間分別約為2.5、5.3、8.5、10.5、12.2、12.4 min，選黃芩苷（B）作為參照峰（S），計算6 個特征峰的相對保留時間、相對峰面積。

圖1 黃芩樣品的UPLC 對照指紋圖譜Fig 1 UPLC spectra of Scutellaria baicalensis samples

圖2 黃芩樣品與黃芩對照品的指紋圖譜Fig 2 Fingerprints of Scutellaria baicalensis sample and standards

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷29 mg、漢黃芩苷6 mg 于同一50 mL 量瓶中（均經(jīng)折算），加甲醇定容，搖勻。配成黃芩苷質(zhì)量濃度為0.58 mg·mL－1、漢黃芩苷質(zhì)量濃度為0.12 mg·mL－1的混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 稱取黃芩粉末（過65目篩）約0.3 g，精密稱定，置于100 mL 具塞錐形瓶中，精密移取50 mL 70%甲醇于錐形瓶中，稱重，超聲50 min，冷卻至室溫后補足失重，搖勻過濾，取1 mL 續(xù)濾液，置于10 mL 量瓶中，加70%甲醇定容，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液，待測。

2.4 含量測定方法學考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密移取混合對照品溶液適量制得黃芩苷質(zhì)量濃度分別為0.5473、0.2736、0.1368、0.0684、0.0342、0.0171、0.0086 mg·mL－1和漢黃芩苷質(zhì)量濃度分別為 0.1108、0.0554、0.0277、0.0139、0.0069、0.0035、0.0017 mg·mL－1的系列混合對照品溶液。吸取各混合對照品溶液2 μL 注入高效液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進行分析。以對照品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，制備標準曲線，得到回歸方程見表3。

表3 黃芩苷與漢黃芩苷回歸方程Tab 3 Regression equation of baicalin and wogonin

2.4.2 重復性試驗 精密稱取同一份黃芩藥材粉末6 份，按“2.3.2”項下方法制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行分析，記錄峰面積，計算黃芩苷、漢黃芩苷平均含量的RSD值分別為1.4%和1.3%，表明方法重復性好。

2.4.3 精密度試驗 精密吸取同一份黃芩供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，每次進樣量2 μL。記錄黃芩苷、漢黃芩苷的峰面積積分值，結(jié)果兩者含量的RSD分別為0.25%和0.36%，表明分析方法精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一黃芩供試品溶液（n＝6），按“2.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12、24 h 進樣，記錄黃芩苷、漢黃芩苷的峰面積，結(jié)果兩者含量的RSD值分別為0.42%和1.3%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收試驗 取已知含量的黃芩藥材0.1 g，各平行操作6 份，分別精密加入黃芩苷對照品（約13 mg）和漢黃芩苷對照品（約3 mg），按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進行檢測，結(jié)果黃芩苷、漢黃芩苷的平均回收率為98.0%和99.2%，RSD＜5%，表明方法回收率良好。

2.5 指紋圖譜方法學考察

2.5.1 精密度試驗 以黃芩苷（B）為參照峰（S），計算其余5個共有峰的相對保留時間與相對峰面積，并采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”進行評價，結(jié)果顯示各共有峰的相對保留時間RSD在0.12%～0.19%，相對峰面積的RSD在0.11%～0.54%，表明儀器精密度良好（見圖3）。

圖3 精密度指紋圖譜Fig 3 Fingerprint of precision

2.5.2 重復性試驗 以黃芩苷（B）為參照峰（S），計算其余5 個共有峰的相對保留時間與相對峰面積，并采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”進行評價，結(jié)果顯示各共有峰的相對保留時間RSD在 0.10%～0.15%，相對峰面積的RSD在 0.26%～3.8%，表明方法重復性良好（見圖4）。

圖4 重復性指紋圖譜Fig 4 Fingerprint of repetitive

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 以黃芩苷（B）為參照峰（S），計算其余5 個共有峰的相對保留時間與相對峰面積，并采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”進行評價，結(jié)果顯示各共有峰的相對保留時間RSD在 0.10%～0.23%，相對峰面積的RSD在 0.38%～1.3%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定（見圖5）。

圖5 穩(wěn)定性指紋圖譜Fig 5 Fingerprint of stability

3 結(jié)果

3.1 樣品含量測定

取26 批次黃芩樣品粉末（過65 目篩）各約0.3 g，每個樣品平行稱取2 份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進行分析，測量黃芩苷和漢黃芩苷的峰面積，計算樣品中黃芩苷和漢黃芩苷的百分含量，結(jié)果見表4。

表4 26 批黃芩樣品中黃芩苷與漢黃芩苷的含量Tab 4 Contents of baicalin and wogonin in 26 batches of Scutellaria baicalensis Georgi

3.2 指紋圖譜建立

分別稱取26 批黃芩粉末按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，注入超高液相色譜儀，得到樣品圖譜，將26 批樣品的色譜數(shù)據(jù)導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”，得到疊加指紋圖譜（見圖6），選擇黃芩苷（B）作為參照峰，計算6 個共有峰的相對保留時間、相對峰面積，結(jié)果相對保留時間的RSD均小于0.70%（見表5和表6），表明各批次之間的相對保留時間重現(xiàn)性和分離度好，特征峰明顯。

表5 26 批黃芩樣品的共有峰相對保留時間Tab 5 Relative retention time of common peaks of 26 batches of Scutellaria baicalensis Georgi

表6 26 批黃芩樣品的共有峰相對峰面積Fig 6 UPLC overlay fingerprints of 26 batches of Scutellaria baicalensis Georgi

圖6 26 批黃芩樣品的UPLC 疊加指紋圖譜Fig 6 UPLC overlay fingerprints of 26 batches of Scutellaria baicalensis Georgi

3.3 相似度分析

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”中位數(shù)法計算26 批黃芩藥材相似度，結(jié)果顯示S1～S26 的相似度均大于0.99，表明不同產(chǎn)地、不同季節(jié)及不同生長年限的黃芩藥材之間質(zhì)量穩(wěn)定，一致性好，無異常樣品。

3.4 聚類分析

以26 批樣品的6 個共有峰相對于黃芩苷（B）的相對峰面積為變量，使用SPSS 22.0 軟件，采用組間連接和平方Euclidean 距離法進行系統(tǒng)聚類分析。結(jié)果顯示，當歐式距離為10 時，26 批樣品共分為5 類，相似度和聚類分析的結(jié)果基本一致，且與樣品的地域性關(guān)系不明顯（見圖7）。

圖7 26 批黃芩樣品聚類分析圖Fig 7 Cluster analysis chart of 26 batches of Scutellaria baicalensis Georgi

4 討論

4.1 提取條件的優(yōu)化

以黃芩苷得率為主要考察指標，考察不同溶劑（體積分數(shù)50%～70%甲醇，間隔10%）、不同目篩（50、65、80 目）和不同超聲時間（50、60、70 min）對提取效率的影響，結(jié)果表明，在70%甲醇，過65 目篩，超聲50 min 時，黃芩苷得率最高，可達17.34%，而按《中國藥典》2020年版的回流提取方法黃芩苷得率僅約12%。

4.2 黃芩苷與漢黃芩苷的含量分析

采集不同產(chǎn)地的26 批樣品中，除河北地區(qū)野生的3 個批次（S24、S25、S26）外，黃芩苷的百分含量均在9%以上，符合《中國藥典》2020年版要求。26 批黃芩藥材的黃芩苷和漢黃芩苷平均含量分別為12.75%、2.66%。山西產(chǎn)黃芩苷和漢黃芩苷含量最高的為春季三年生黃芩，陜西產(chǎn)黃芩苷和漢黃芩苷含量最高的為春季二年生黃芩，山東產(chǎn)黃芩苷和漢黃芩苷含量最高的為秋季二年生黃芩，甘肅產(chǎn)黃芩苷和漢黃芩苷含量最高的為秋季二年生黃芩，河北產(chǎn)黃芩苷和漢黃芩苷含量最高的為承德頭溝鎮(zhèn)春約一年生黃芩。5 個產(chǎn)地綜合比較，山東秋季二年生黃芩的黃芩苷含量最高，甘肅秋季二年生黃芩的漢黃芩苷含量最高。河北承德高臺寺鎮(zhèn)春野生2 中黃芩苷和漢黃芩苷含量均最低，河北野生黃芩中黃芩苷和漢黃芩苷的含量明顯比栽培黃芩低，這可能與其枯心和粗皮性狀以及表面泥土較多有關(guān)。

不同生長年限中的黃芩苷和漢黃芩苷含量差異較大，但可以發(fā)現(xiàn)黃芩苷和漢黃芩苷含量總體呈二年生＞一年生＞三年生＞野生的規(guī)律，二年生含量達到最高值。不同產(chǎn)地的黃芩苷平均含量：陜西＞山東＞甘肅＞山西＞河北，其中陜西、山東和甘肅產(chǎn)地的黃芩苷平均含量較一致，均在14%左右，河北產(chǎn)地黃芩苷含量最低，約9%；不同產(chǎn)地的漢黃芩苷平均含量：山東＞甘肅＞陜西＞山西＞河北，除河北地區(qū)較低外（約2%），其余4 個主產(chǎn)地的漢黃芩苷含量均在3%左右。

4.3 小結(jié)

本試驗在超高效液相色譜儀的基礎(chǔ)上，結(jié)合超聲優(yōu)化提取方法，采用0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）的流動相，梯度洗脫14 min，測定黃芩中的黃芩苷和漢黃芩苷的含量，并建立6 種黃酮類成分的指紋圖譜。各批次之間的相對保留時間重現(xiàn)性和分離度好，準確可靠，可為完善黃芩的質(zhì)量控制與評價提供參考。