離子抑制色譜法測定伊班膦酸鈉原料藥中的有關物質

陳霞，張潔，董瑞（成都市食品藥品檢驗研究院，成都 610045）

伊班膦酸鈉，化學名稱為1-羥基-3-（N-甲基-戊胺基）-亞丙基二膦酸-鈉鹽-水合物，臨床上用于治療絕經后骨質疏松癥、惡性腫瘤溶骨性骨轉移以及伴有或不伴有骨轉移的惡性腫瘤引起的高鈣血癥，目前的劑型為注射液[1-4]。該藥物的最后一步合成中，通常會產生諸如亞磷酸根、磷酸根、1-羥基-3-戊胺基-亞丙基二膦酸、1-羥基-3-甲胺基-亞丙基二膦酸等雜質[5-6]。伊班膦酸鈉和這些雜質的結構皆沒有發色基團，也不具備電化學活性，故不能用常規的紫外、熒光或電化學分析方法檢測。目前報道伊班膦酸鈉及伊班膦酸鈉注射液中有關物質檢測方法的文獻較少，且未見同時檢測N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸鹽酸鹽、亞磷酸、雜質B、雜質D、磷酸、雜質G、N-去甲基雜質，并能排除氯離子、碳酸根、硫酸根干擾的報道[7-15]。本文建立了離子色譜抑制法同時測定伊班膦酸鈉原料藥中7 個有關物質的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

離子色譜儀Thermo IC5000，包括自再生抑制器（Dionex AERS 500），電導檢測器，進樣器（Dionex AS-DV）；十萬分之一天平（MS205DU METTER TOLEDO），超純水儀（Milli-Q）。

1.2 試藥

對照品伊班膦酸（USP，批號：R013F0，純度：99.9%）；N-去甲基雜質（批號：20161002-D，純度：100%）、雜質G（批號：20181004-D，純度：100%）、雜質D（批號：D-181101，純度：100%）（A 制藥股份有限公司）；雜質B（TLC，批號：2641-091A3，純度：99.4%）；N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸鹽酸鹽（成都叮當時代科技有限公司，批號：DTYQ0605-13-D，純度：100%）；亞磷酸、磷酸（中國食品藥品檢定研究院）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Dionexionpac AS11-HC 色譜柱（4 mm×250 mm，9 μm）；AG11-HC 保護柱（4 mm×50 mm）；以100 mmol·L－1NaOH 為流動相A、水為流動相B，梯度洗脫（見表1）；流速：1.0 mL·min－1；檢測器：抑制性電導檢測器；檢測器溫度：35℃；抑制器：Dionex AERS 500 4 mm；抑制器電流：110 mA；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

2.2 溶液配制

2.2.1 供試品溶液 取伊班膦酸原料藥，精密稱定，加水溶解并定量稀釋制成每1 mL 中約含伊班膦酸鈉5 mg 的溶液，作為供試品溶液。

2.2.2 系統適用性溶液 取伊班膦酸鈉對照品和磷酸對照品各適量，加水溶解并定量稀釋制成每1 mL 約含伊班膦酸5 mg、磷酸5 μg 的混合溶液，作為系統適用性溶液。

2.2.3 混合對照品溶液 精密稱取伊班膦酸鈉對照品和N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸鹽酸鹽、伊班膦酸N-去甲基、亞磷酸、磷酸對照品各適量，加水溶解并定量稀釋制成每1 mL 約含伊班膦酸5 μg、N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸鹽酸鹽5 μg、伊班膦酸N-去甲基5 μg、亞磷酸10 μg、磷酸15μg 的溶液，作為混合對照品溶液。

2.3 專屬性考察

精密量取空白溶劑（超純水）、伊班膦酸鈉雜質B、N-去甲基雜質、雜質G、雜質D、N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸鹽酸鹽、磷酸和亞磷酸適量，加超純水溶解作為對應的定位溶液；取上述各溶液適量混合后作為混合定位溶液；另取樣品溶液加入混合定位溶液進樣20 μL，記錄色譜圖。見圖1，結果表明：溶劑不干擾已知雜質和主成分的檢出；各已知雜質之間、已知雜質與主成分之間的分離度均符合要求。

圖1 專屬性考察圖譜Fig 1 Ion suppression chromatogram of specificity

2.4 強制降解試驗

為考察本品可能的降解途徑及擬訂色譜條件對降解產物的檢測能力，確定強制降解產物是否為已知雜質，本研究對原料進行了強制降解試驗，樣品制備方法見表2。取上述各供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖，強制破壞試驗結果見表3及圖2。

圖2 伊班膦酸強制破壞試驗Fig 2 Forced degradation of ibandronate sodium

表2 強制降解條件Tab 2 Forced degradation condition

表3 強制破壞試驗結果Tab 3 Forced degradation

結果顯示，本品在酸、堿、氧、高溫和光照條件下均未產生較大未知雜質，且破壞條件足夠強烈，遠遠超過本品儲存條件，故未繼續加劇破壞條件。且各破壞條件下，雜質與主成分峰之間的分離度均大于1.5，表明擬訂的色譜條件能夠滿足各已知雜質及降解產物的有效檢出及分離。

2.5 檢測限（LOD）和定量限（LOQ）

精密量取“2.2”項下對照品混合液適量，逐級稀釋，以信噪比（S/N）約為3 時的進樣濃度為其檢測限（LOD），以信噪比（S/N）約為10 時的進樣濃度為其定量限（LOQ），并平行配制6 份進行檢測。

以擬訂供試品濃度5 mg·mL－1，進樣體積為20 μL 時，各雜質的檢出能力均低于絕對進樣量的0.02%（限度的20%），各雜質的定量限均小于報告限（本品的最大日劑量小于2 g，根據ICH的要求，原料有關物質的報告限為0.05%）。

2.6 線性關系考察

按“2.2.3”項下方法配制每1 mL 約含伊班膦酸N-去甲基雜質、雜質B、雜質D、雜質G、N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸各50 μg、磷酸150 μg 和亞磷酸100 μg 的混合溶液，作為線性儲備液；精密量取線性儲備液逐級稀釋，制成系列雜質線性溶液。精密量取上述各線性溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸，結果見表4。

表4 標準曲線、線性范圍、檢測下限和定量下限Tab 4 Regression equation，linearity，LODs and LOQs

2.7 精密度考察

量取對照品溶液按“2.1”項下方法測定，連續進樣6針，記錄色譜圖，考察進樣精密度，結果N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸鹽酸鹽、亞磷酸、雜質B、雜質D、磷酸、雜質G、N-去甲基雜質色譜峰面積的RSD分別為0.34%、0.21%、3.0%、0.23%、0.17%、1.2%、0.40%，表明方法精密度良好。

2.8 重復性考察

按“2.10”項下方法配制100%的加標供試品溶液，平行配制6 份。照“2.1”項下色譜條件進行測定，計算每份樣品中已知雜質的含量。結果N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸鹽酸鹽含量RSD為2.6%；亞磷酸的含量RSD為1.1%；雜質B 的含量RSD為1.9%；雜質D 的含量RSD為1.81%；N-去甲基雜質的含量RSD為1.3%；磷酸的含量RSD為1.8%；雜質G 的含量RSD為0.72%，說明擬定的檢測方法重復性符合要求。

2.9 穩定性考察

參照“2.10”項下方法配制對照品溶液與加標供試品溶液，在室溫下放置不同的時間，進樣測定，考察各溶液的穩定性。結果表明室溫條件下，對照品溶液放置12 h，各雜質峰面積RSD小于3.0%，穩定性良好；供試品溶液放置12 h，各雜質峰面積RSD小于3.0%，穩定性良好。

2.10 回收試驗

取伊班膦酸鈉原料約50 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，分別精密加入“2.4”項下線性儲備溶液適量，制成含限度濃度50%、100%、150%的加標供試品溶液，每個濃度平行制備3 份，照“2.1”項下色譜條件進行檢測，結果N-甲基-N-戊基-β-氨基丙酸鹽酸鹽、亞磷酸、雜質B、雜質D、磷酸、雜質G、N-去甲基雜質的平均回收率均在93.48%～100.30%，RSD在1.2%～5.5%。

2.11 樣品測定

取伊班膦酸鈉原料按照擬訂的檢測方法測定，結果見表5。

表5 伊班膦酸鈉中有關物質檢測結果Tab 5 Detection of related substances in ibandronate sodium

3 討論

伊班膦酸鈉原料藥中存在較多的陰離子，故采用梯度洗脫的方式，即改變流動相中氫氧化鈉溶液的濃度，使各雜質之間、雜質與主成分之間分離度均能達到要求；且在預試驗中發現，采用100 mmol·L－1NaOH-水（22∶78）等度洗脫，除雜質G 外，其余各峰峰形和分離度良好；雜質G 峰形一般且響應較低；雜質D 峰拖尾；故用梯度優化雜質G 的峰形。氫氧化鈉溶液的濃度梯度由初始的16 mmol·L－1增加至45 mmol·L－1時，各雜質與主峰間能夠達到分離要求，各陰離子峰之間均無干擾。

本文采用陰離子交換-抑制電導方式進行檢測，不僅可以得到很低的背景電導，提高檢測靈敏度，而且樣品前處理簡單，只需溶解稀釋即可進樣分析。