應用于大視場生物成像分析儀的離軸三反顯微物鏡設計

劉廣興，張 洋，朱海龍，尹煥才，唐玉國1, *

（1.中國科學技術大學生物醫學工程學院，安徽合肥230026；2. 中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所，江蘇 蘇州 215163）

1 引 言

隨著社會的進步和科技的不斷發展，在生命科學、食品藥品檢測、環境安全等領域中，都有從大量待測目標物中識別出少量/稀有（百萬分之一）目標的需求，精準的檢測結果是后續分析的前提。針對稀有細胞或痕量病原微生物的快速實時檢測是最為典型的從大樣本中檢測極少目標物的代表，如果可以有效解決該問題將對癌癥的早期診斷治療和預防提供可靠且便捷的監控，也可為其他重大疾病的早期診斷和治療提供有力監測手段，此外，還可以為保證食品、藥品、空氣等的質量與安全提供有效工具[1]。

目前針對稀有細胞或痕量病原微生物檢測的方法主要有直接計數法、顯微熒光計數法和流式細胞術等。直接計數法計數準確，可靠性高且成本低，常用于細胞/細菌檢測，但檢測前需要進行細胞培養，以實現稀有細胞的增殖，使其達到可觀測水平，其檢測速度較慢，檢測時長達48~72 h，不能滿足一些特定的快速、實時的檢測需求[2]。顯微熒光計數法主要是篩選目標細胞表面的特異性抗原，并對其進行特異性熒光標記，然后將其置于熒光顯微鏡下觀測，并手動計數。利用此方法進行檢測時，顯微鏡單次觀測區域較小，要實現對大量樣本的檢測，需要對目標物品進行多次不同視野的觀測，導致檢測時間較長。另外，由于高倍顯微鏡的景深較小，觀測中會存在部分目標物離焦的現象，因此需要反復對焦，增加了人工計數的難度[3]。流式細胞術需要先對目標細胞進行預處理，制作單細胞懸浮液，然后進行具有特異性和化學定量關系的熒光染色，懸浮液中的細胞逐一通過流動室，利用激光作為激發光源，同時測定目標細胞所攜帶的熒光種類及相對強度，進而用于細胞分群、功能鑒定等[4]。流式細胞術具有速度快，多參數檢測的優點，但其要求被測目標物濃度不低于102~103/mL數量級，檢測限過高，用于稀有細胞（如CTC細胞）和痕量微生物檢測時，其系統誤差過大。綜上所述，以上幾種方法都存在著一定的局限性，因此，研制一種新型的大視場生物成像分析儀，在一定范圍內實現大視場和高分辨率，提高稀有細胞和痕量病原微生物的檢測速度和精度，具有重要的實際意義。

對于作為大視場生物成像分析儀的核心顯微物鏡部分，本文以同軸三反成像理論為基礎，采用視場離軸的方式設計了一款光譜范圍為350~1 100 nm、放大倍數β=?1，視場范圍為150 mm×20 mm，相對孔徑大于0.1的用于大視場生物成像分析的離軸三反顯微物鏡，模擬分析了該離軸三反顯微物鏡的成像質量，建立了大視場生物成像分析儀系統檢出性能評價方法，最后使用該系統檢測帶有熒光標記的靶細胞，對大視場生物成像分析儀進行性能評價。

2 光學結構和系統參數

2.1 系統技術指標

樣品前處理需要對7.5 ml全血進行紅細胞裂解，剩余至少7.5×107個以上的白細胞和若干稀有細胞，白細胞的直徑一般在10~15μm，若將這些細胞以單層的形式平鋪在載片上，所需面積大于1.687 5×104mm2，為了不影響觀測質量，白細胞不可能一一密排，以細胞密度覆蓋率為75%計算，所需的載片面積應大于2.25×104mm2。由于CTCs細胞直徑略大于白細胞直徑，極限情況下，為保證清晰度，一個CTC細胞需占兩個像素，因此像元要小于5μm，若要獲得更高的清晰度，以一個CTC細胞占3個像素計算，所設計的離軸三反顯微物鏡的成像分辨率要小于3.5μm。因此，光學系統的設計指標應滿足：成像視場≥150 mm×20 mm；成像分辨率≤3.5μm。

2.2 光學系統方案

對于如此大物面的物方視場，在設計上即可采用反射式系統實現，也可采用折射式系統實現。其中反射式系統一般包含同軸反射和離軸反射兩種，可采用離軸三反光學結構實現大視場及高分辨成像[5]，折射式系統可在雙高斯結構的基礎上進行復雜化，從而實現大視場成像。由于反射式系統的光譜范圍不受限制，因此，可以選用不同種類的熒光試劑，以用于不同細胞和痕量微生物檢測，而折射式系統在寬光譜范圍內，很難消除二級光譜，從而影響整個儀器的普遍適用性。同時反射式系統可以設計為對稱共軛系統，可以消除系統的畸變像差，提高成像質量，而折射式系統的畸變則受到材料的限制，雖然畸變可以矯正到較小的程度，但不能實現系統零畸變。考慮到系統的光譜范圍和畸變特性，所以本設計選擇反射系統作為優選方案。

離軸三反射光學系統根據光路中是否存在中間像，可分為RUG型和COOK型，RUG型結構的光闌位于主鏡處，離軸時采用光闌離軸方式，系統中間存在像面。COOK型結構的光闌設置在次鏡處，離軸時采用視場離軸方式，系統不存在中間像面。由于COOK型離軸三反系統的光路結構具有一定的對稱性，不但可以設計成近遠心光路，還可以很好地矯正畸變。同時，由于COOK型結構的對稱性，可以將主三鏡設計成完全對稱的結構，從而將三片式離軸三反射系統簡化成兩片式，從而能夠減少裝調時的調整自由度，降低裝調難度[6-7]。

根據光學系統的參數要求，綜合以上分析，本文最終選擇COOK型離軸三反結構進行設計。

2.3 光學系統參數確定

根據技術指標要求，檢測載片尺寸要求為150 mm×20 mm，檢測精度需達到3.5μm時，此時需要的單列最大像元總數為：

由于物面尺寸比較大，在保證放大率的同時還需控制成像焦面的尺寸，此時應盡量減小探測器像元的尺寸，但探測器像元尺寸太小時，耐奎斯特頻率會很高，此時成像質量又難以保證，結合現有探測器技術水平，選用多片像元尺寸為3.1μm的CHR70MCMOS探測器拼接成像，所以此時像面尺寸為：

所以此時系統的放大倍數為

此CCD奈奎斯特頻率為：

當系統需要達到3.5μm的分辨率時，根據瑞利判據

當主波長λ=0.56μm時，可得

考慮到物鏡前大尺寸位移平臺、濾光片模塊等結構的安裝空間，所以顯微物鏡的物象共軛距離不能太短，但如果顯微物鏡的物象工作距離過長，則會導致主鏡、次鏡和三鏡口徑過大，增加加工、檢測及裝調的難度。綜合結構上的考慮，令顯微物鏡物象共軛距L=3 000 mm。根據公式：

f′=750 mm

則顯微物鏡焦距 ，所以光學系統的指標確定為：(1)設計波段：350~1 100 nm；(2)線視場：150 mm×20 mm；(3)數值孔徑：0.1；(4)放大倍率：?1；(5)MTF@162 lp/mm：≥0.3；(6)物象共軛距：3 000 mm；(7)焦距：750 mm。

3 光學系統設計及像質分析

離軸三反系統一般是在同軸三反系統設計完成后采用孔徑離軸、視場離軸方式進行離軸得到的，所以離軸三反系統的設計一般以求解同軸三反系統的初始結構為出發點[8]。圖1為同軸三反系統的一般表示形式。M1、M2、M3分別表示主鏡、次鏡和三鏡，它們的曲率半徑分別為R1、R2和R3，其非球面系數分別為?e12、?e22、?e32，3個反射鏡的間距分別為d1、d2，l2、l2′、l3和l3′分別表示次鏡和三鏡的物距和像距，系統的像方焦距為主鏡的焦距為

圖1 同軸三反結構圖Fig.1 Coaxial three-mirror system

在初始結構求解時，首先將M2設置為孔徑光闌，并令此時本系統將變為一個像方遠心光學系統。然后，根據三反系統的平場條件，可推導出平場像方遠心光學系統中R1、R2、R3、d1、d2、d3與系統焦距f′及次鏡M2對主鏡M1的遮攔比a1的關系式。再根據三級像差理論, 即可推導出平像場遠心三反系統的三級球差SⅠ、彗差SⅡ和像散SⅢ與?e12、?e22、?e32和a1的關系式。然后令SⅠ、SⅡ、SⅢ為零，d1=|d2|，即可得到主三鏡共面的同軸三反系統的初始結構[9-12]。

將得到的同軸三反系統的初始結構進行離軸優化，當離軸三反系統具有良好的成像質量時，再將無限遠共軛系統的工作距慢慢調整為有限遠。最終設計結果如表1所示，系統結構圖如圖2所示。

表1 光學系統的設計結構參數Tab.1 Configuration parameters of optical system

圖2 系統結構示意圖Fig.2 Schematic diagram of designed system

系統優化后的各個視場的調制傳遞函數（MTF）曲線如圖3所示，各個視場的MTF值如表2所示。從圖3和表2可以看出，優化后的系統在整個波段和視場范圍內的成像質量都接近衍射極限，在Nyquist截止頻率178 lp/mm處的MTF均值為0.357。光學系統的畸變圖如圖4所示。優化后離軸三反光學系統的畸變在全部視場下都為0%。系統的點列圖如圖5（彩圖見期刊電子版）所示，各個視場的RMS值如表3所示。從圖4和表3可以看出點列圖RMS直徑均值為3.56μm。圖6為系統組裝完成后的實際測試圖，采用NBS 1963A分辨率測試板，由圖6可知在144 lp/mm處，仍可分辨黑白條紋，由此可得系統實際分辨率約為3.5μm。

圖5 系統點列圖Fig.5 Systerm spot diagram

圖6 分辨率測試圖Fig.6 Resolution test

表 3系統各個視場RMS直徑Tab.3 RMS spot sizes of the system with different field of views

圖3 離軸三反系統MTF曲線Fig.3 MTF curves of coaxial three-mirror system

表2 系統各視場MTF值Tab.2 MTF values of the system with different field of views

圖4 系統畸變圖Fig.4 System distortion diagram

4 系統檢出性能評價方法的建立

4.1 系統檢出率

大視場生物成像分析儀光學系統需要在數十萬個目標中精確識別出帶有熒光標記的靶細胞，其檢出率需大于95%，才能滿足現有稀有細胞的檢測需求。因此，擬采用與實際細胞尺寸一致的空白微球制作校準品，其中M個空白微球作為待測細胞，并且摻入N個熒光微球作為靶細胞，將其平鋪在大視場載片上后，使用本系統進行檢出率評價。具體判斷標準如下：若本系統檢出熒光微球G個，那么該系統的目標細胞檢出率為G/N。

4.2 校準品制備

空白微球采用分散聚合與種子溶脹聚合相結合的方法，通過調整聚合單體、引發劑、分散劑等參數，實現低CV值的10μm粒徑微球的合成，其孔徑為30 nm，CV<5%。在此基礎上，將量子點作為熒光染料，進一步制備熒光微球，具體流程如下：配置氯仿、正丙醇混合液作為反應溶液，體積比為9∶1；將量子點、微球按一定比例加入反應溶液，超聲15 min，置于真空干燥箱干燥，至反應溶液完全揮發；揮發后的體系加入1 ml環己烷重懸并混勻，采用離心機以3 000 r/min 離心5 min，經過棄上清，留沉淀；重復上述操作2~3次后，干燥去除環己烷。干燥好的量子點微球中加入無水乙醇重懸待用。進一步對空白微球的形貌及熒光微球進行表征，具體結果如圖7所示。

圖7 (a)空白微球SEM表征及(b)熒光微球MERGE圖Fig.7(a)SEMcharacterization of blank microspheres and(b)fluorescent microsphere MERGE diagram

通過對兩種微球制備并表征后發現，制備的空白微球尺寸在10μm左右，符合細胞的尺寸需求。量子點熒光微球制備完成后并未改變微球的形態，熒光分布均一。本文制備的包含量子點的熒光微球的發射光譜分別為450，520，638 nm，滿足大視場熒光檢測的需求。進一步使用摻入實驗在約10 000個空白微球中精確摻入100個熒光微球，使用系統檢測熒光識別出的數量，用于評判系統檢出率。該試驗連續重復3次。

4.3 試驗結果

將制作的樣品以單層厚度鋪片到面積為150 mm×200 mm的載玻片上，用大視場生物成像分析儀進行檢測，對檢出的熒光微球進行計數，試驗裝置和試驗結果分別如圖8、圖9所示。該試驗連續重復3次后發現，在共計10 100個微球中系統檢出的熒光微球數平均為98個，故系統檢出率為98%，達到了目標細胞檢出率>95%的設計要 求。

圖8 試驗裝置圖Fig.8 Test device diagram

圖9 試驗結果Fig.9 Test results

5 結 論

本文利用離軸三反光學系統消像散技術設計了一種放大倍數為?1，視場范圍為150 mm×20 mm，相對孔徑大于0.1的大視場生物成像分析儀的顯微物鏡。在COOK式離軸三反光學結構的基礎上設計了主三鏡一體化式結構，使裝調時的調整自由度減少，從而降低了裝調難度。設計結果表明，該系統的分辨率可達3.5μm，在截止頻率178 lp/mm處全視場的MTF均值為0.357，成像質量接近衍射極限，滿足大視場生物成像分析儀的設計要求。在稀有細胞以及痕量病原微生物檢測方面進行實驗，結果表明其檢出率達98%。本方法具有視場大、分辨率高、檢測速度快等優點，對于稀有細胞和痕量病原微生物檢測具有重要科學意義和實用價值。