基于3D打印技術SF/PVA/HA復合骨支架的制備及表征

安田田，許 燕，周建平，張旭婧

(新疆大學 機械工程學院，新疆 烏魯木齊 830047)

0 引言

骨缺損是由創傷、感染、腫瘤、骨髓炎手術清創以及各種先天性疾病等導致的一種常見臨床病。目前，醫學上治療骨缺損主要方法為自體骨移植和異體骨移植，自體骨移植是現今最理想的治療方法，但是自體骨來源有限且會對機體產生新的創傷，異體骨移植則可能伴有強烈的免疫反應且可傳播疾病。為克服這些缺陷，研制和尋找理想的骨缺損修復生物材料，已成為醫學和生物材料科學領域的一個重要課題。

1993年，Vacati與Lannger[1]提出骨組織工程的概念，為治療骨缺損修復提供了新的方法和策略，即三維成型骨組織工程支架植入患者病灶缺損處，最終可達到骨修復目的。生物3D打印技術在骨組織工程支架的成型中廣泛應用[2]，此技術通過計算機設計模型生成路徑，調控打印速率，逐層打印模型，較好解決骨修復過程中骨組織工程支架的構建問題，而目前生物3D打印骨支架材料的開發是研究的熱點問題。絲素蛋白(SF)是從天然蠶絲中提取的高分子蛋白，富含18種氨基酸并相互排列成線性結構。獨特的分子結構和優良的生物相容性，有利于細胞的黏附和生長，在組織工程中廣泛應用[3-4]。SF的分子鏈構象主要包含3種：無規卷曲、α-螺旋和β-折疊結構，其功能特性取決于分子構象。SF力學性能不足，但在一定條件下，可誘導SF分子構象由α-螺旋和無規線團結構轉變為β-折疊結構，提高SF的機械性能[5]。聚乙烯醇(PVA)是一種具有親水性、粘接性、生物相容性和優良力學性能的高聚物，被廣泛制備成薄膜、納米纖維[6]、水凝膠和多孔支架等。羥基磷灰石(HA)是人體骨骼中最主要的無機礦物成分[7]，是一種具有良好生物相容性的生物活性材料，與骨可形成良好的化學鍵性結合并促進新骨生長，是骨植入材料研究的熱點。但HA存在可塑性差、脆性大、受載易斷裂等缺點，常常需要與其他生物材料復合來改善性能的不足[8]。方艷等人[9]以SF、HA、聚己內酯(PCL)作為生物材料，通過超聲混合，采用二次冷凍干燥法制備出新型骨組織工程材料，可用于骨缺損修復。徐水等人[10]以SF與HA為基材，磷酸緩沖液為溶劑，戊二醇為交聯劑，使用氣泡致孔法制備出高強度力學性能多孔支架材料，且與人體多孔骨的結構相近。吳蕾等人[11]將SF凝膠經過電泳作用形成SF固溶膠，再將SF凝膠礦化后表面形成的鈣磷沉積物，反復清洗去鹽后凍干得SF/HA復合支架，支架能夠更好地促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞的分化。Zhang等人[12]將HA與PVA復合并反復凍融提高了材料的機械強度與耐磨損性能。程威等人[13]將SF、 HA、膠原(Col-I)進行共混，低溫3D打印出成孔連通性良好的骨支架，為骨缺損修復材料的甄選提供參考。

基于相關研究，本文將SF、PVA、HA三種生物材料通過工藝復合，復合材料克服了HA單一使用時的性能不足，增強支架材料的機械性能與生物性能。設計三因素四水平正交試驗探究材料之間最優配比參數，通過擠出成型3D打印技術，制備出結構完整的多孔骨支架，并對骨支架的理化性能及生物相容性進行檢測和分析，旨在探究骨支架材料可行性和安全性，為治療骨缺損尋找理想修復材料。

1 實驗

1.1 材料與試劑

蠶繭、羥基磷灰石(粒徑40 nm，純度96%南京愛普瑞納米材料有限公司 )、聚乙烯醇、溴化鋰、碳酸鈉均為分析純，透析帶(截留分子量 6 000～8 000,北京索萊寶科技有限公司 )、DMEM低糖培養基、胎牛血清(Gibco，美國)、兔成骨細胞(新疆醫科大學第一附屬醫院動物中心提供)。

1.2 儀器與設備

微機控制電子萬能試驗機(方辰儀器設備有限公司)、HH-1 數顯恒溫水浴鍋(金壇市城東新瑞儀器廠)、離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)、高精度數字電子秤(浙江凱豐集團有限公司)、冷凍干燥箱(力辰科技有限公司)、自主研制快速成型裝置。

1.3 復合骨支架制備

1.3.1SF溶液制備

稱取一定量的蠶繭，剪碎后放入濃度為0.5%的碳酸鈉溶液中，在98～100 ℃條件下脫膠30 min，冷卻后用去離子水沖洗，以上操作重復3次，擠出水分，干燥。將脫膠后的蠶絲按浴比1∶4加入9.3 mol/L的溴化鋰溶液中，在90℃溫度下溶解120 min，溶絲過程中不斷攪拌。再將SF溶液裝入透析袋中并將其兩端封閉，用去離子水透析4 d，期間每3 h換水一次。收集透析袋中SF溶液，在3 000 r/min轉速下離心10 min，取上清液，重復2次，4 ℃保存備用。

1.3.2骨支架的制備

按預先確定的質量比稱取一定量PVA加入SF溶液中，在90℃水浴鍋加熱攪拌45 min，待PVA完全溶解到SF溶液，即可得SF/PVA復合凝膠。再按預先設定的比例稱取納米HA與SF/PVA水凝膠混合，攪拌均勻后裝入3D打印料筒中。利用3D打印裝置的上位機編譯G代碼設計打印軌跡與控制三維運動平臺的速率，運動控制器調控步進電機驅動的噴頭控制裝置，達到擠壓速率與復合材料黏度匹配，保證出絲均勻控制支架質量，啟動擠出式3D裝置打印復合材料骨支架，最后骨支架進行冷凍干燥。

1.3.3正交實驗設計

以SF溶液濃度、SF與PVA質量比、SF/PVA體積與HA質量的比為自變量，將材料放入模具，制成直徑0.8 cm，高度1 cm的試樣，以最大壓縮強度為評價指標，確定材料最優配比。因素與水平設計如表1所示。

1.4 復合材料測試與表征

1.4.1力學性能測試

將SF/PVA/HA干燥樣品在電子萬能試驗機上進行材料力學性能的測定。樣品直徑8 mm，高度10 mm，測試環境為室溫。采用1 kN的傳感器，壓縮速度為1 mm/min，重復3次。繪制應力-應變的曲線，得到復合材料最大壓縮強度，材料的彈性模量為

(1)

其中，F為試驗力，A為橫截面積，L為試樣高度，ΔL為軸向變形，σ為正應力，ε為應變。

表1 正交試驗設計因素與水平Tab.1 Coded and actual values of independent variables

1.4.2骨支架形貌

選擇出絲直徑為0.85 mm的針頭，使用擠壓成型裝置打印10 mm×10 mm×2.4 mm骨支架。采用排水法[14]計算骨支架孔隙率，測量步驟如下：首先電子秤測量骨支架的干重m1，再將材料置于蒸餾水中，使蒸餾水完全浸入材料孔隙中；約10 min后將支架取出，再次稱量骨支架濕重m2，骨支架的孔隙率(P)的計算公式為

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其中，ρ為蒸餾水的密度，V為骨支架體積。

1.4.3X射線衍射

取一定量骨支架復合材料，均勻平鋪于X射線衍射儀樣品臺上，掃描角度0°～50°，掃描速度4 °/min進行檢測，使用JADE 5.0軟件分析數據。

1.4.4傅立葉紅外光譜

將干燥樣品與溴化鉀粉末混合，壓片，在紅外光譜儀上掃描32次，分辨率4 cm-1，測定范圍為400～4 000 cm-1，使用Origin 9.1作圖分析。

1.4.5材料細胞毒性實驗

首先制備浸提液，將干燥的SF/PVA水凝膠和SF/PVA/HA復合支架進行高溫高壓蒸汽滅菌處理，按50 mg/mL的浸提比例制備浸提液。以兔子成骨細胞為實驗細胞，制成濃度為104個/cm2細胞懸液，接種于96孔板，每孔加入100 μL細胞懸液，待細胞貼壁，棄原培養基，更換為浸提液，以單純培養基為空白對照，每組3孔，37 ℃培養箱中培養于1 d、3 d、5 d取出加入10 μL的CCK-8試劑孵育3 h后，在450 nm波長下檢測各孔吸光度(OD)值。最后進行細胞相對增殖率(RGR)計算，公式為

(3)

2 結果與分析

2.1 正交試驗結果

壓縮強度與彈性模量是評價骨支架材料機械性能的主要參數，通過正交試驗優化骨支架中各材料之間的配比，確定材料最佳制備工藝參數，三因素四水平正交試驗設計及結果見表2。

表2 正交試驗設計及結果Tab.2 Orthogonal test design and results

正交試驗以壓縮強度為評價指標，以彈性模量為參考指標，表2的正交試驗結果計算出的均值與極差可以得出影響復合骨支架材料機械性能的因素主次順序是：PVA∶SF(質量比)>SF水溶液濃度>PVA/SF水凝膠∶HA；其最佳工藝參數：SF溶液濃度3%、PVA∶SF(質量比)=5∶1、PVA/SF水凝膠∶HA=1.6 mL∶1 g。

2.1.1正交試驗驗證

按照正交試驗優化得到的工藝參數組合進行壓縮實驗驗證，設置3組平行試樣，壓縮強度分別為9.390 MPa、11.432 MPa、11.586 MPa，其最優組合壓縮實驗結果如圖1所示；計算彈性模量分別為117.5 MPa，162.8 MPa，153.3 MPa，支架材料力學性能提高，實驗結果說明正交試驗可以較好地優化復合材料配比參數的可行性。

圖1 壓縮實驗結果Fig.1 Results of compression experiment

2.2 骨支架形貌

使用機械擠壓快速成型裝置成功制備出絲均勻，結構完整，孔隙率較大SF/PVA/HA復合骨支架，如圖2所示。根據式(1)計算骨支架孔隙率約為(55±1.5)%，按照最優材料配比制備的混合材料黏度適中，打印過程中出絲流暢，孔隙率可控，支架絲材之間孔隙均勻，網狀結構規則，具有較好的力學性能和孔隙連通性，可以增大支架的有效面積，有利于骨細胞增殖與分化與營養物質運輸。

圖2 10 mm×10 mm×2.4 mm骨支架宏觀形貌Fig.2 10 mm×10 mm×2.4 mm bone scaffold macroscopic morphology

2.3 X射線衍射掃描分析

利用XRD對各個材料進行分析，從圖3的XRD圖譜中可以看出，純SF(c)的 XRD 分析圖譜在2θ=19.7°有一個明顯的特征衍射峰，純SF主要以Silk I(α-螺旋)結構為主[15]。純PVA(b)在19.5°、22.8°、41.0°附近出現特征衍射峰，而SF/PVA水凝膠(a)在41.0°的衍射峰變得不明顯，在22.8°處的衍射峰基本消失，而只在19.6°出現一個明顯的衍射峰，可以說明SF與PVA共混后分子結構發生了一定的轉變，形成了某種新的結構，證明SF與PVA分子之間存在一定的相互作用，有利于改善水凝膠的力學性能。SF/PVA/HA復合物中SF與PVA由于含量較少和結晶度較弱，其主要顯示HA的特征衍射峰并且與標準卡羥基磷灰石的衍射峰基本吻合，無其他磷酸鹽成分，表明HA與SF/PVA水凝膠物理混合過程中無其他物質生成，SF/PVA的添加對HA晶體結構物無影響。

圖3 不圖復合材料XRD圖譜Fig.3 XRD pattern of composite

2.4 傅立葉紅外光譜分析

由圖4傅立葉紅外光譜圖可知，純SF(b)在1 654 cm-1、1 536 cm-1、1 224 cm-1有明顯吸收峰，表明制備的純SF中主要以無規卷曲和α-螺旋結構為主。在SF與PVA混合后，其主要的峰值出現在1 649 cm-1、1 421 cm-1、1 329 cm-1，吸收峰發生較明顯的偏移，表明SF與PVA復合后，SF分子和PVA分子間發生了一定程度的相互作用。純PVA(a)在3 164 cm-1處是-OH的吸收峰，PVA/SF復合凝膠在3 264 cm-1處出現-OH吸收峰向高波數偏移，說明該作用為分子間的氫鍵相互作用。在SF/PVA/HA復合材料(c)的紅外圖譜中1 036 cm-1、602 cm-1、564 cm-1代表不同結構空間的PO43-特征峰，同時也表現出SF/PVA水凝膠的特征峰，說明HA與SF/PVA水凝膠為物理混合，無發生相互作用，與X-射線衍射分析結果一致。

注： a PVA；b SF；c SF/PVA/HA復合材料；d SF/PVA水凝膠

2.5 細胞毒性實驗結果

通過體外細胞毒性實驗驗證復合材料的安全性，兔成骨細胞與SF/PVA水凝膠、SF/PVA/HA骨支架材料進行CCK-8法檢測并計算細胞相對增值率。表3是SF/PVA水凝膠、SF/PVA/HA骨支架材料于1 d、3 d、5 d計算出的細胞相對增值率，SF/PVA水凝膠與SF/PVA/HA骨支架的細胞增值率均大于75%，根據ISO10993-5—2009醫療器械生物學評價體外細胞毒性試驗，試樣的細胞相對增殖率大于70% 可認為無毒，則SF/PVA/HA骨支架材料無毒副作用，具有良好的生物安全性。

表3 復合材料細胞相對增值率Tab.3 Relative value-added rate of composite cells

3 討論

理想的骨缺損修復材料應具備的條件[16]是：1)可塑性強，可被加工成所需的形狀，并保持良好機械強度。2)良好的生物相容性和表面活性，為細胞提供生長和繁殖的微環境。3)較高的孔率，易于細胞營養成分的滲入以及細胞代產物的排出。4)一定的降解性能，保持缺損處達到骨支架降解速率與新骨形成速率相匹配。本文設計正交試驗快速高效優化各材料之間的配比參數，最優參數組合制備出的復合材料的壓縮強度和彈性模量都提高，滿足骨缺損修復材料的力學性能。通過3D打印技術制備多孔SF/PVA/HA組織工程骨支架，保證骨支架有較高的孔隙率和孔連通性，三維結構為細胞提供良好生長空間并有利營養物質流動。SF與PVA復合形成的水凝膠兩種材料的分子之間發生一定的相互作用，有良好的結合性，改善水凝膠的韌性和黏結性，HA與SF/PVA水凝膠混合形成的復合骨支架材料具有優異的機械特性，克服HA單一材料力學強度和脆性大等局限性。CCK-8法是一種高效高靈敏度的細胞毒性檢測方法且檢測誤差小[17]，用其方法檢測體外細胞毒性實驗得出SF/PVA/HA復合骨支架材料無毒性，可以安全應用于生物醫學領域，也為后期動物體內相容性和降解實驗提供了依據。

4 結論

本課題選取生物材料HA、PVA以及SF，通過正交試驗探究出骨支架材料之間配比，當SF溶液濃度為3%、SF與PVA質量比為1∶5、SF/PVA水凝膠與HA的比為1.6 mL∶1 g時，組織工程骨支架的機械性能最優。通過X射線衍射和傅立葉紅外光譜分析SF/PVA/HA復合材料的晶態與分子構象的結構特征，得出SF分子與PVA分子間發生一定程度相互作用，兩者有良好的結合性；體外細胞毒性實驗驗證骨支架材料有良好的生物安全性。本研究采用3D打印技術制備的SF/PVA/HA組織工程骨支架具有成型質量好、優良的機械性能、較高的孔隙率和良好的生物安全性等優點，是較理想的骨缺損修復材料。下一步研究中還需對細胞在骨支架材料內部增殖黏附狀況以及材料降解速率進行深入探索。