濃香型白酒大曲制曲過程真菌群落結構變化的研究

唐清蘭，周 利，徐姿靜

(四川劍南春集團有限責任公司，四川綿竹 618200)

大曲在濃香型白酒釀造中起著接種微生物、投糧、糖化發酵和生香的作用，它的質量好壞直接影響到白酒的產量和質量，是傳統固態白酒釀造的物質基礎[1-2]。由于大曲的制作過程是敞開式、自然接種，且制曲過程長達數月，因此富集在其中的微生物種類和數量與環境、水分、溫度等條件息息相關。因此，大曲培養過程是一個復雜的微生物動態變化過程，微生物種類和數量在此過程中此消彼長，賦予了大曲糖化、發酵和生香等功能，為釀酒發酵提供動力[3-4]。

大曲微生物主要有細菌和真菌兩大類，其中真菌在釀酒過程的產酒、產酶、產香等方面起到重要作用，因此大曲真菌的研究是釀酒微生物體系研究中不可忽視的環節[5]。隨著現代分子生物技術的發展，高通量測序等技術廣泛應用于大曲微生物的研究，該方法可以檢測到相對豐度較低的微生物以及不可培養的微生物，克服了傳統可培養技術操作繁瑣、準確性差、局限性大等缺點，能夠客觀地認識大曲復雜的微生物群落結構及其變化規律，挖掘更多的生物學信息[6-8]。施思等[9]利用高通量測序對濃香型大曲貯藏階段的真菌多樣性進行分析，發現大曲真菌群落結構不斷變化，畢赤酵母屬、根霉屬和恒梗霉屬為最終優勢菌群。夏玙等[10]研究了貯藏期不同干燥方式和不同儲存方式對大曲真菌群落的影響。吳樹坤等[11]對四川不同地區的濃香型大曲微生物群落結構進行比較，發現不同區域的微生物群落結構確實存在差異，遂寧大曲的真菌多樣性比宜賓和瀘州的要豐富。目前，很多關于濃香型白酒大曲真菌微生物群落結構的報道都集中在大曲制曲過程的某個階段或某個時間點上，而本實驗則是跟蹤研究濃香型白酒大曲整個制曲過程，在不同時間點取樣分析，剖析濃香型白酒大曲從入房發酵到成品可用這個過程的真菌微生物群落結構變化，為生產優質濃香型大曲和揭示濃香型白酒微量風味物質形成原因提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

曲樣：劍南春不同制曲階段大曲。

耗 材：引 物ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA），引物ITS2R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC），Soil DNA Kit試劑盒（OMEGA）。

1.2 實驗方法

濃香型大曲曲醅壓制成型后堆入房間進行培菌，在第2 d、5 d、12 d、24 d 取樣，分別命名為N_2d、N_5d、N_12d和N_24d；接著多層堆碼進行入庫儲存，此階段在入庫、貯存1 個月、貯存3 個月3 個時間點取樣，分別命名為N_R、N_Z1 和N_Z3，儲存結束后可用于釀酒生產的是成品曲，取樣并命名為N_C。整個過程共取樣8 個，所有樣本在取樣后立即用干冰冷凍。

采用引物ITS1F 和ITS2R 對真菌ITS 區進行擴增，并高通量測序，每個樣品做3 個平行，進行真菌微生物群落結構的多樣性分析。

2 結果與分析

2.1 稀釋曲線（圖1）

圖1 稀釋曲線

圖1 是以Chao 指數來反映本實驗中濃香型白酒大曲不同制曲階段樣本的真菌稀釋曲線，Chao指數常用來估計物種總數。本實驗對8 個不同發酵期的濃香型大曲進行測序，在97%相似度的OTU 水平進行Chao 指數計算，每個樣本的測序深度為43757 條序列。由圖1 可以看出，隨著測序深度增加，Chao 指數曲線逐步趨于平緩，說明本實驗測序數據量足夠大，可以代表樣本的真菌微生物多樣性信息。

2.2 多樣性指數（表1）

表1 Alpha多樣性指數

表1 為濃香型白酒大曲不同制曲階段真菌Alpha 多樣性指數，本試驗通過Coverage、Shannon、Simpon、Ace 和Chao 5 個指標對大曲真菌群落Alpha 多樣性進行分析。可以看出，各樣本Covergae≥0.9997，說明本次測定結果能夠真實地反映樣本中真菌的多樣性。不同制曲階段的大曲真菌多樣性指數均存在差異，Shannon 和Simpson 反映樣本中真菌物種多樣性，結果表明，物種種類在制曲過程中不斷變化。Ace 和Chao 指數反映樣本中真菌群落的豐富度，可以看出，隨著時間延長，真菌豐富度呈先下降后緩慢增加的趨勢。綜合分析，發酵12 d 到入庫這個階段是制曲轉折期，此階段因為大曲溫度升高、水分下降等原因，生長條件變得嚴苛，不適合生長的微生物不斷消亡，而利于生長的微生物逐步富集。

2.3 不同制曲階段Venn圖（圖2）

圖2 屬水平下不同制曲階段大曲Venn圖

圖2 是屬水平下不同制曲階段濃香型白酒大曲的真菌Venn 圖，重疊部分的數字代表不同制曲階段的大曲共有物種數量，非重疊部分的數字代表各階段特有物種數量，由圖2 可知，有12 種真菌微生物為各階段所共有，其中第2 天和第12 天特有物種數分別為6 種和4 種，其他階段特有物種數≤2，說明整個制曲階段真菌微生物種類進行著動態變化，但多數微生物種類保持一致。

2.4 真菌群落結構分析

2.4.1 門水平下真菌群落結構分析（圖3）

圖3 門水平下不同制曲階段大曲真菌組成圖

圖3 是門水平下不同制曲階段濃香型白酒大曲真菌組成圖，可以看出子囊菌門（Ascomycota）占有絕對優勢，豐度值均在98.8%以上，毛霉菌門（Mucoromycota）在不同制曲階段均被檢出，但是含量極低。

2.4.2 屬水平下真菌群落結構分析（圖4）

圖4 為濃香型白酒大曲不同制曲階段在屬水平上的真菌群落組成圖。伊薩酵母屬（Issatchenkia）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、曲霉屬（Aspergillus）、假絲酵母屬（Candida）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、紅曲霉屬（Monascus）、粉狀米勒氏酵母屬（Millerozyma）、釀酒酵母屬（Saccharomycopsis）均被檢出。其中，伊薩酵母屬（Issatchenkia）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、曲霉屬（Aspergillus）分別在制曲過程不同時期占據主導地位。

圖4 屬水平下不同制曲階段大曲真菌組成圖

伊薩酵母屬（Issatchenkia）廣泛存在于釀酒生產中，有較高的產乙醇和產酯能力。該菌在發酵前12 d 占主導地位，第2 天豐度值最高，為89.6%，之后逐步降低，第12 天降為59.5%，后面幾個階段均較低，儲存1 個月、3 個月豐度分別為8.4%和1.5%。分析出現此現象是因為培養初期大曲溫度較低、水分適中，適于酵母菌的生長繁殖，因此數量較高，隨著發酵進行，大曲溫度升高，水分減少，不利于酵母菌的生長，酵母菌數量急劇下降。

嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）和嗜熱真菌屬（Thermomyces）均是嗜熱菌，該類微生物耐高溫，其最低生長溫度為20 ℃或20 ℃以上，最高生長溫度為50 ℃或50 ℃以上，可產生嗜熱酶，包括纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等，這些嗜熱酶在高溫條件下保持極好穩定性，有利于大曲產酒生香作用。濃香型大曲為中高溫大曲，在制曲階段溫度可到50 ℃以上，這為嗜熱真菌的生長和繁殖提供了良好條件，有研究發現，嗜熱真菌廣泛存在于濃香型大曲中[12-14]。其中，嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）在發酵第5 天開始出現，發酵24 d 時豐度最高，可達94.1%，隨后降低，最后成品曲中達46.4%。嗜熱真菌屬（Thermomyces）在第12、24 天，入庫3 個月和成品曲中豐度值分別為2.6%、3.1%、4.3%和0.9%，其他階段幾乎未被檢出。嗜熱菌的存在正體現了制曲溫度對大曲品質的影響。

曲霉屬（Aspergillus）是大曲中種類眾多的一類微生物，耐糖和耐鹽能力強，糖化酶系發達，主要為大曲提供糖化力、液化力、蛋白質分解能力及多種有機酸等物質。整個階段其數量幾乎呈增加趨勢，儲存3 個月時達到高峰，豐度為74.4%，成品曲中達52.3%。

假絲酵母屬（Candida）具有產乙醇和產香能力，能發酵生成多元醇和呋喃酮類，豐度在整個發酵期呈下降趨勢，在第2、5、12 天分別為9.4%、1.7%和2.6%，其他階段含量極低。

紅曲霉屬（Monascus）為腐生真菌，嗜乳酸，能產生糖化酶、淀粉酶，也能產生辛酸、癸酸、月桂酸、豆蔻酸、油酸、亞油酸以及相應乙酯等微量成分，對發酵產物的風味和質量有利。本研究發現，該微生物在制曲第5 天和第12 天被檢出，豐度值分別為1.7%和0.7%。

粉狀米勒氏酵母屬（Millerozyma）呈瓜子橢圓形，菌落呈白色，該菌具有一定的耐鹽性，能產生醇類和酮類等物質。僅在第12 天被檢出，豐度值為2.3%。

釀酒酵母屬（Saccharomycopsis）在自然界分布甚廣，發酵過程主要產乙醇，同時還能生成多種有機酸、高級醇和酯類物質，這些物質在白酒的風味中發揮重要作用。該菌在第12 天時豐度相對較高，為1.5%，其他階段較低。

綜上分析，伊薩酵母屬（Issatchenkia）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、曲霉屬（Aspergillus）為主導優勢菌。伊薩酵母屬（Issatchenkia）在制曲發酵期豐度高，而嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）和曲霉屬（Aspergillus）在儲存和成品階段數量較多。由此可知，制曲整個階段前期是接種酵母屬，為大曲的釀酒和生香提供菌源，制曲后面階段主要是耐高溫和曲霉類微生物的生長，為大曲提供糖化、液化以及生香相關的微生物。

3 結論

本研究運用高通量測序技術，解析了濃香型白酒大曲整個制曲過程中的真菌菌群結構變化。發現門水平下，子囊菌門（Ascomycota）占有絕對優勢；屬水平下，伊薩酵母屬（Issatchenkia）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、曲霉屬（Aspergillus）分別在制曲過程不同時期占據主導地位。通過群落結構的動態演變過程，可以剖析濃香型白酒大曲的糖化、發酵和生香等功能與微生物間的潛在關系。該技術的應用，大大提高了對大曲微生物認識的深度和寬度，對生產優質大曲和釀造優質白酒具有重要意義。