“無稻草，不翻倉，控溫控濕”曲房創(chuàng)新對高溫大曲微生物組成的影響研究

山其木格，唐 平，王 麗，王 凡，畢榮宇，李長文，盧 君

（1.貴州國臺(tái)酒業(yè)集團(tuán)股份有限公司，貴州仁懷 564501；2.天士力控股集團(tuán)有限公司研究院，天津 300410）

醬香型白酒使用貴州紅纓子糯高粱作為釀酒原料，采用“四高兩長”即高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒和生產(chǎn)周期長、貯存時(shí)間長的獨(dú)特釀造工藝，使得眾多微生物共同參與白酒發(fā)酵，使其具有“醬香突出，幽雅細(xì)膩，酒體醇厚，回味悠久，空杯留香持久”的風(fēng)格特點(diǎn)，深受廣大消費(fèi)者的青睞。醬香型高溫大曲作為糖化、發(fā)酵及生香劑，在醬香型白酒生產(chǎn)過程中扮演著極其重要的作用。高溫大曲是以小麥、水為原料，稻草為輔料，依靠曲母及環(huán)境帶入的各種微生物，經(jīng)過自然培菌、高溫發(fā)酵、儲(chǔ)存而成[1-2]。在傳統(tǒng)的醬香型大曲的生產(chǎn)過程中會(huì)按比例篩選新稻草和老稻草，作為生產(chǎn)用稻草，用于大曲發(fā)酵。新草略硬，骨力和吸水性較好；老草略軟，骨力略差，但接種了制曲過程的豐富的微生物、酶和香味物質(zhì)。稻草在醬香型大曲的發(fā)酵過程中，起到隔離曲塊防止粘連、保溫、保濕、透氣的作用[3-5]。制曲使用過的老稻草因附著了釀酒微生物，還可作為下一輪制曲的輔料重復(fù)使用，起到接菌的作用[6-8]。周天慈等[9]基于高通量測序技術(shù)分析中高溫大曲及其制作環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)，利用微生物溯源追蹤技術(shù)對大曲中的微生物來源進(jìn)行分析。研究結(jié)果表明，大曲發(fā)酵初期細(xì)菌89.3%來自于原料，5.6%來自于室內(nèi)草席。

隨著工業(yè)技術(shù)的進(jìn)步，國內(nèi)一些大型酒廠也基本實(shí)現(xiàn)了白酒生產(chǎn)機(jī)械化。但是醬香型白酒高溫制曲的某些生產(chǎn)關(guān)鍵環(huán)節(jié)仍不能被機(jī)械化操作所代替，表現(xiàn)尤為明顯的就是高溫大曲的倉內(nèi)發(fā)酵環(huán)節(jié)（包括翻倉工序），可以說曲倉發(fā)酵過程是醬香型白酒機(jī)械化釀造模式轉(zhuǎn)型升級的難點(diǎn)，也是機(jī)械化變革進(jìn)程中尚未被打通的“最后一公里”。醬香型白酒傳統(tǒng)的曲房發(fā)酵環(huán)節(jié)，存在生產(chǎn)效率低、勞動(dòng)強(qiáng)度大、占用面積大、大曲質(zhì)量差異大、工作環(huán)境粉塵大、對制曲工人身體健康不利等缺點(diǎn)[10-12]。因此，貴州國臺(tái)酒莊有限公司嘗試?yán)矛F(xiàn)代工程裝備技術(shù)對傳統(tǒng)的制曲發(fā)酵環(huán)節(jié)進(jìn)行改造，即在具有控溫、控濕、供氧、對流等功能的曲房中采用無稻草、不翻倉、靜止培養(yǎng)、均衡發(fā)酵的方式完成大曲的發(fā)酵過程，從而在保證曲塊質(zhì)量的前提下實(shí)現(xiàn)醬香型高溫大曲生產(chǎn)自動(dòng)化。本試驗(yàn)采用高通量測序技術(shù)，對傳統(tǒng)曲房大曲（CT）、控溫控濕曲房大曲（ZN）及生產(chǎn)用稻草（DC）的微生物群落組成進(jìn)行研究，探明稻草微生物多樣性及兩種不同方式發(fā)酵的大曲在微生物組成上的差異。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

曲樣的選取：傳統(tǒng)曲房大曲（CT）、控溫控濕曲房大曲（ZN）以及生產(chǎn)用稻草（DC）均取自貴州國臺(tái)酒莊有限公司制曲車間。傳統(tǒng)曲房大曲（CT）和控溫控濕曲房大曲（ZN）為兩種不同方式發(fā)酵而成的出倉曲。傳統(tǒng)曲房大曲（CT）是通過醬香型高溫大曲傳統(tǒng)工藝發(fā)酵而成，優(yōu)質(zhì)小麥經(jīng)潤麥、粉碎、拌曲、踩曲成型、入倉堆積、一次翻倉、二次翻倉等工序完成大曲發(fā)酵，倉內(nèi)擺放時(shí)為了防止曲塊粘連，并且為了達(dá)到保溫、保濕、透氣的作用，會(huì)用到生產(chǎn)用稻草。而控溫控濕曲房大曲（ZN）是根據(jù)傳統(tǒng)曲房溫濕度的變化規(guī)律，人為地調(diào)整曲倉的溫濕度，大曲自始至終擺放在曲架上靜止培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中沒有一次翻倉和二次翻倉等繁瑣工序，也沒有稻草用于制曲生產(chǎn)。兩種大曲發(fā)酵方式不同，但二者都接入了相同的母曲，應(yīng)用相同的小麥原料，且擁有相同的制曲環(huán)境。大曲的取樣采用5 點(diǎn)取樣法，即選取曲塊中心點(diǎn)以及對角線與中心點(diǎn)距離相等的4個(gè)點(diǎn)作為取樣點(diǎn)，選取的樣品進(jìn)行粉碎混合。生產(chǎn)用稻草為老稻草與新稻草以9∶1 比例混合樣品，與實(shí)際生產(chǎn)要求一致。所有樣品用無菌袋密封分裝，冷凍保存于冰箱-20 ℃。3 種樣品各5 個(gè)，每個(gè)樣各兩個(gè)平行。

儀器和試劑：熒光分光光度計(jì)Quantifluor-ST fluorometer E6090 購自Promega 公司；PCR 擴(kuò)增儀bio-rad t100；Flx800 酶標(biāo)儀購自BioTek公司；DNeasy PowerSoilKit 試劑盒購自Mo Bio/QIAGEN公司；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 試劑盒購 自P7589Invitrogen；Pyrobest DNA Polymerase DR500A 購自TaKaRa 公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（AP-GX-500）購自Axygen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微生物組總DNA的提取

生產(chǎn)用稻草置于無菌三角瓶中，用無菌PBS 緩沖液沒過樣本。以200 r/min 轉(zhuǎn)速振蕩40 min，將振蕩后的PBS 溶液經(jīng)兩層無菌紗布過濾，去除雜質(zhì)。過濾后的緩沖液以0.22 μm 的硝酸纖維素濾膜進(jìn)行過濾，過濾后的濾膜放置在無菌一次性平皿中，封口膜封口，保存于-20 ℃。大曲和稻草微生物樣本采用DNeasy PowerSoilKit 進(jìn)行微生物組總DNA的抽提，并對抽提的DNA 進(jìn)行檢測。采用熒光分光光度計(jì)在260 nm 和280 nm 處分別測定DNA 的吸光值，檢測DNA 的濃度，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的質(zhì)量。調(diào)整DNA 溶液濃度，DNA工作液保存于4 ℃，儲(chǔ)存液保存于-20 ℃。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增

以樣本微生物組總DNA 為模板，擴(kuò)增出細(xì)菌16S rDNA V3—V4 可變區(qū)和真菌ITS1（a）區(qū)，供樣本微生物群落分析。應(yīng)用擴(kuò)增引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′ ）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），擴(kuò)增得到細(xì)菌16S rDNA V3—V4 可變區(qū)片段，產(chǎn)物約480 bp。同樣以樣本微生物組總DNA 為模板，應(yīng)用擴(kuò)增引物ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′），擴(kuò) 增得到真菌ITS1（a）區(qū)，產(chǎn)物約250 bp。PCR 反應(yīng)條件為：98 ℃，4 min；98 ℃變性30 s；55 ℃退火40 s；72 ℃延伸60 s；27個(gè)循環(huán)；72 ℃，7 min。

1.2.3 高通量測序與數(shù)據(jù)分析

針對細(xì)菌16S rDNA V3—V4 可變區(qū)和真菌ITS1（a）區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行割膠回收并純化目標(biāo)條帶，利用BioTek 酶標(biāo)儀對樣品進(jìn)行定量，最后采用標(biāo)準(zhǔn)的Illumina TruSeq DNA 文庫制備實(shí)驗(yàn)流程（Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Guide）構(gòu)建所需的上機(jī)文庫。測序與建庫由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。測序平臺(tái)為IlluminaNova，測序策略PE-250。DADA2 方法（Benjamin et al.,2016）主要進(jìn)行去引物，質(zhì)量過濾，去噪（denoise），拼接和去嵌合體等步驟。它不再以相似度聚類，只進(jìn)行去重（dereplication）或者說相當(dāng)于以100%相似度聚類。使用DADA2 質(zhì)控后產(chǎn)生的每個(gè)去重的序列稱為ASVs（amplicon sequence variants），或稱為特征序列（對應(yīng)于OTU 代表序列），將ASV 代表序列與Silva（Release 132,http://www.arbsilva.de）和UNITE 數(shù)據(jù)庫（Release 8.0，https://unite.ut.ee/）（Koljalg et al.,2013）比對，進(jìn)行分類學(xué)注釋。根據(jù)各樣品物種豐富度情況，利用得出的ASV結(jié)果計(jì)算樣品中生物多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和覆蓋率指數(shù)（Coverage）等。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物群落Alpha多樣性分析

應(yīng)用高通量測序技術(shù)分析傳統(tǒng)曲房大曲（CT）、控溫控濕曲房大曲（ZN）和生產(chǎn)用稻草（DC）的微生物組成，共測得細(xì)菌16S V3—V4 區(qū)高質(zhì)量READ 共計(jì)2871161 個(gè)，真菌ITS1 區(qū)高質(zhì)量READ共計(jì)3244170 個(gè)。對于細(xì)菌，每個(gè)樣品平均95705個(gè)READ（69965～109809 個(gè)READ，N=10）。對于真菌，每個(gè)樣品平均108139 個(gè)READ（93147～120924 個(gè)READ，N=10）。細(xì)菌和真菌稀疏曲線均趨于平穩(wěn)，說明測序深度符合要求，樣品具有足夠代表性，見圖1。

圖1 細(xì)菌及真菌稀疏曲線

每個(gè)OTU 的代表序列根據(jù)OTU 在不同樣本中的豐度分布，評估每個(gè)樣本的多樣性水平。對各組樣本在屬水平的具體組成進(jìn)行分析，并檢驗(yàn)組間是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)稻草的細(xì)菌多樣性最高，稻草細(xì)菌多樣性極顯著高于傳統(tǒng)曲房大曲（P=0.00051，P＜0.005）和控溫控濕曲房大曲（P=0.00088，P＜0.005）?？販乜貪袂看笄?xì)菌多樣性略高于傳統(tǒng)曲房大曲，但并無顯著性差異（P=0.26，P＞0.05）。真菌多樣性情況也類似，稻草的真菌多樣性極顯著高于傳統(tǒng)曲房大曲（P=0.00016，P＜0.005）和控溫控濕曲房大曲（P=0.00016，P＜0.005）。控溫控濕曲房大曲真菌多樣性略高于傳統(tǒng)曲房大曲，但也無顯著性差異（P=0.17，P＞0.05），見表1和圖2。

表1 微生物群落Alpha多樣性

圖2 細(xì)菌、真菌的alpha多樣性

2.2 細(xì)菌組成分析

在細(xì)菌屬水平分析傳統(tǒng)曲房大曲（CT）、控溫控濕曲房大曲（ZN）和稻草（DC）微生物多樣性，共測得683 個(gè)屬的細(xì)菌，其中稻草524 個(gè)屬，傳統(tǒng)曲房大曲102 個(gè)屬，控溫控濕曲房大曲458 個(gè)屬。傳統(tǒng)曲房發(fā)酵過程中大曲都是層層壘起堆放，比較密實(shí)，空氣流動(dòng)性較差，會(huì)造成發(fā)酵頂溫較高且頂溫維持時(shí)間較長，因而，高溫且密閉環(huán)境的篩選作用使得一些不耐高溫微生物不易存活，逐漸被淘汰。這可能是導(dǎo)致傳統(tǒng)曲房大曲微生物多樣性較為單一的原因。三組樣本中，稻草微生物種類最為豐富，它包含Bacillus（20.68%），Pantoea（11.78%），Saccharopolyspora（10.21% ），Methylobacterium（8.47%），Staphylococcus（7.70%），Curtobacterium（5.11%），Acinetobacter（4.84%），Sphingomonas（4.33%），Pseudonocardiaceae（2.69%），Pseudomonas（2.07%），Planomicrobium（1.91%），Exiguobacterium（1.08%），Sphingobacterium（0.94%），Kineococcus（0.82%），Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium（0.79% ），Quadrisphaera（0.60%），Aureimonas（0.55%），Lysinibacillus（0.46%），Prauserella（0.45%）以及Oceanobacillus（0.45%）等屬的細(xì)菌，且與傳統(tǒng)曲房大曲共有Bacillus，Oceanobacillus，Staphylococcus，Saccharopolyspora，Pseudonocardiaceae，Pantoea等多種優(yōu)勢細(xì)菌屬，見圖3。這點(diǎn)也證明了文獻(xiàn)[7]中報(bào)道，稻草在大曲發(fā)酵過程中起到接菌的作用。但圖3 中也可以看到，控溫控濕曲房大曲與稻草共有的微生物多于傳統(tǒng)曲房大曲與稻草共有微生物。因此，可以推斷稻草雖然具有接菌的作用，但在大曲發(fā)酵中并不是主要的微生物來源。

圖3 細(xì)菌屬水平VEEN圖

對每組樣品細(xì)菌組成相對豐度進(jìn)行組內(nèi)均值處理，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)曲房大曲（CT）與控溫控濕曲房大曲（ZN）的優(yōu)勢微生物非常相似，均為Virgibacillus，Kroppenstedtia，Scopulibacillus3 個(gè)屬的細(xì)菌，在細(xì)菌組成比例分別占88.04%和87.28%。只是在該兩種大曲中優(yōu)勢細(xì)菌屬的占比有所差異。傳統(tǒng)曲房大曲中最多是Virgibacillus（66.13%），其次是Kroppenstedtia（20.42%），再次是Scopulibacillus（1.50%）。而在控溫控濕曲房大曲中最多是Kroppenstedtia（46.52%），其次是Scopulibacillus（20.75%），再次是Virgibacillus（20.02%），見圖4。除此之外，在豐度最高的20個(gè)菌屬中，兩種大曲也共同擁有Bacillus，Oceanobacillus，Staphylococcus，Thermoactinomyces，Lactobacillus，Saccharopolyspora，Lactococcus，Pseudonocardiaceae，Klebsiella，Chloroplast等多個(gè)菌屬，見圖4。

圖4 細(xì)菌屬水平豐度圖

傳統(tǒng)曲房大曲（CT）和控溫控濕曲房大曲（ZN）中占比87%～88%的優(yōu)勢細(xì)菌組成一致，且在豐度最高的20 個(gè)菌屬中，兩種大曲也共同擁有Bacillus、Oceanobacillus、Staphylococcus、Thermoactinomyces、Lactobacillus等10 多個(gè)菌屬。但是通過PCA 分析，發(fā)現(xiàn)該兩種大曲樣本相互仍可以區(qū)分，見圖5，而且其細(xì)菌組成豐度Pearson 相關(guān)系數(shù)僅為0.5725。分析原因可能是：雖然兩種方式發(fā)酵的大曲在優(yōu)勢細(xì)菌組成上非常相似，但優(yōu)勢微生物相對占比明顯不同所造成。細(xì)菌屬水平相對豐度熱圖中展示了前50 個(gè)屬的相對豐度，比例尺顯示細(xì)菌群落歸一化豐度（%）的變化范圍，見圖6。

圖5 細(xì)菌屬水平PCA分析圖

圖6 細(xì)菌屬水平相對豐度熱圖

2.3 真菌組成分析

在真菌屬水平分析傳統(tǒng)曲房大曲（CT）、控溫控濕曲房大曲（ZN）和稻草（DC），共測得221 個(gè)屬的真菌，其中稻草215 個(gè)屬，傳統(tǒng)曲房大曲28 個(gè)屬，控溫控濕曲房大曲40 個(gè)屬。3 組樣本真菌多樣性情況與細(xì)菌多樣性類似，可能也是傳統(tǒng)曲房和控溫控濕曲房發(fā)酵方式的不同，造成傳統(tǒng)曲房大曲真菌多樣性稍低于控溫控濕曲房大曲。從圖7 中可以看出，稻草真菌種類也最為豐富，含有Aspergillus（11.55%），Mycosphaerella（9.75%），Saitozyma（8.17% ），Wallemia（4.66% ），Papiliotrema（4.25%），Byssochlamys（2.65%），Moesziomyces（2.64% ），Hannaella（2.39% ），Thermoascus（1.49%），Alternaria（1.11%），Pyrenochaetopsis（0.76% ），Arthrinium（0.42% ），Neoascochyta（0.27% ），Lichtheimia（0.21% ），Trichoderma（0.14%）和Septoria（0.13%）等屬的真菌。且與傳統(tǒng)曲房大曲共有Aspergillus，Thermoascus，Byssochlamys和Rhizomucor等多種優(yōu)勢真菌屬，見圖7。

圖7 真屬水平VEEN圖

對每組樣品真菌組成相對豐度進(jìn)行組內(nèi)均值處理，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)曲房大曲（CT）與控溫控濕曲房大曲（ZN）的優(yōu)勢真菌屬也很相似，主要為Thermoascus、Thermomyces和Rasamsonia3個(gè)屬的真菌，在真菌組成比例分別達(dá)到98.56%和98.57%。傳統(tǒng)曲房大曲（CT）中，最多的是Thermoascus（74.70%），其次是Thermomyces（23.84%），再次是Rasamsonia（0.02%）。在控溫控濕曲房大曲（ZN）中，最多的也是Thermoascus（94.67%），但其次是Rasamsonia（3.87%），再次是Thermomyces（0.03%）（見圖8）。除此之外，在豐度最高的20 個(gè)菌屬中，兩種大曲也共同擁有Rhizopus，Aspergillus，Pichia，Byssochlamys，Phialemoniopsis，Lichtheimia，Cladosporium，Xeromyces等多個(gè)菌屬，見圖8。

圖8 真菌屬水平豐度圖

傳統(tǒng)曲房大曲（CT）和控溫控濕曲房大曲（ZN）中占比98%以上的優(yōu)勢真菌組成一致，且在豐度最高的20 個(gè)菌屬中，兩種大曲也共同擁有Rhizopus，Aspergillus，Pichia，Byssochlamys，Phialemoniopsis等十多個(gè)菌屬。但是通過PCA 分析，發(fā)現(xiàn)該兩種大曲樣本也基本可以區(qū)分，見圖9?？梢妰煞N方式發(fā)酵的大曲雖然在優(yōu)勢真菌屬組成上相似，但優(yōu)勢真菌和其他一些真菌的相對占比上也存在一些差異，見圖10。真菌屬水平相對豐度熱圖中展示了前50 個(gè)屬的相對豐度，比例尺顯示細(xì)菌群落歸一化豐度（%）的變化范圍。但與細(xì)菌組成相比，該兩種大曲在真菌組成及豐度上比較接近，其Pearson相關(guān)系數(shù)也達(dá)到了0.9505。

圖9 真菌屬水平PCA分析圖

圖10 真菌屬水平相對豐度熱圖

3 結(jié)論

本研究中，通過高通量測序技術(shù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)稻草的微生物多樣性最為豐富，并且與傳統(tǒng)曲房大曲共有Bacillus，Oceanobacillus，Staphylococcus，Saccharopolyspora，Pseudonocardiaceae，Pantoea等多種優(yōu)勢細(xì)菌屬和Aspergillus，Thermoascus，Byssochlamys和Rhizomucor等多種優(yōu)勢真菌屬的微生物，也證實(shí)了稻草在醬香型大曲發(fā)酵過程中的接菌作用。但與此同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)，無論是細(xì)菌或真菌組成上，控溫控濕曲房和傳統(tǒng)曲房發(fā)酵的出倉曲共同擁有多種優(yōu)勢菌屬，且發(fā)酵中未用稻草的控溫控濕曲房大曲反而微生物多樣性更為豐富。所以，我們推斷稻草雖然起到微生物接種的作用，但不是主要的微生物來源。大曲發(fā)酵中微生物主要來源應(yīng)該是母曲、原料、制曲條件及環(huán)境等其他因素，這一點(diǎn)與周天慈等[9]的研究結(jié)論相符。

從傳統(tǒng)曲房和控溫控濕曲房發(fā)酵的醬香型高溫大曲微生物區(qū)系的初步研究中發(fā)現(xiàn)，該兩種大曲雖然工藝不同，但因接入了相同的母曲，應(yīng)用相同的小麥原料，且擁有相同的制曲溫濕度條件，所以共同擁有著多種優(yōu)勢微生物，微生物多樣性并無顯著性差異。左乾程等[13]利用高通量測序技術(shù)對醬香型白酒機(jī)械化制曲發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)機(jī)械化制曲與傳統(tǒng)制曲過程優(yōu)勢菌具有較高的相似性，與本文研究結(jié)論相似。但是，本研究僅對傳統(tǒng)曲房和控溫控濕曲房所生產(chǎn)的出倉曲進(jìn)行了初步的微生物區(qū)系研究，后期還需進(jìn)一步進(jìn)行大曲儲(chǔ)存過程以及后期釀酒應(yīng)用方面的效果驗(yàn)證。本試驗(yàn)對比了醬香型白酒高溫大曲在發(fā)酵過程中“是否使用稻草、是否翻倉”對于出倉曲微生物菌群的影響，對于未來高溫大曲倉內(nèi)發(fā)酵過程的機(jī)械化升級，提供了重要的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。