功能菌在醬香型白酒生產過程中的研究

王 西，陳 波，劉 幫，張亞東，尹杰兵，楊靖洲

（1.四川郎酒股份有限公司，四川古藺 646523；2.四川省醬香型白酒生態釀造工程技術研究中心，四川古藺 646523）

醬酒是我國三大傳統白酒之一，以其醬香突出，幽雅細膩，酒體醇厚，空杯留香持久的風味特點為消費者所喜愛[1]。醬酒是以糯紅高粱、小麥、水為原料，高溫大曲為糖化發酵劑，經傳統固態發酵、固態蒸餾、陳釀、勾調，不直接或間接添加食用酒精及非白酒發酵產生的呈色呈香呈味物質，具有醬香風格的白酒[2]。醬酒采用傳統開放式生產工藝，通過攤晾、添加曲藥、堆積糖化等工序網羅大量微生物，使其進入釀造體系發揮生香發酵作用。

糖化發酵劑俗稱酒母、曲藥，是將糧食中的淀粉經糖化、發酵生化反應而轉化成乙醇及微量香味成分。在醬酒生產過程中，微生物主要來源于曲藥、空氣、原料、窖泥等，其中有益微生物的種類與數量對釀酒發酵生香有巨大作用，本研究在醬酒第5 輪次生產過程中加入一定量的醬香功能菌，以探索醬香功能菌對醬酒生產的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：糟醅、酒樣（四川古藺郎酒廠）；醬香功能菌（復合菌）從郎酒高溫大曲中篩選而制成。

試劑：酚酞指示劑（10 g/L）；氫氧化鈉標準溶液（0.1 mol/L）；20%氫氧化鈉溶液；斐林試劑；葡萄糖標準溶液（0.1%）；鹽酸溶液（1+4）；乙醇溶液；乙酸丁酯內標溶液；M5635-02 DNA 提取試劑盒，Omega；75510-019 Agarose，Invitrogen；DL15000 或DL2000 Marker，Takara；AM9870 TAE，Invitrogen；M0491L Q5? High-Fidelity DNA Polymerase，NEB；P7589 Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，Invitrogen；High Sensitivity DNA Kit，Agilent；細菌16S rRNA V3—V4 區PCR 擴增引物（338F：5-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'；806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）[3]。

儀器設備：食品級不銹鋼電子測溫計；電子鼓風干燥箱；干燥器；蒸發皿；燒杯；電爐；量筒；7890A 氣相色譜儀，Agilent；優普超純水制造系統，成都超純科技有限公司；高速離心機；NC2000-微量紫外分光光度計，Thermo Scientific；DYY-6C 電泳儀，北京六一；Axygen 凝膠回收試劑盒；BG-gds-AUTO(130)凝膠成像系統，北京百晶；2720 PCR 擴增儀，ABI；FLX800T 酶標儀，BioTek；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit；FLx800-Microplate reader，BioTek；TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit，Illumina；Bioanalyzer，Agilent；Microplate reader(BioTek,FLx800)；NovaSeqPE250，Illumina。

1.2 試驗方法

1.2.1 醬香功能菌在醬酒生產過程中的應用探究

在第4 輪次生產結束后，選取發酵結束的6 口窖池，分為2 組，每組3 口窖池。同時開窖，每口窖池每排各取1 甑出池糟醅，為保證糟醅初始理化性質基本一致，將取自于6 口窖池的糟醅拌和均勻，平均分配，同時進行取酒、蒸糧、攤晾操作，待糟醅攤晾至32 ℃時添加曲粉，Ⅰ組（試驗組）添加混合曲粉（高溫大曲+投糧量2‰醬香功能菌），Ⅱ組（常規組）添加等量的高溫大曲，拌和均勻后各甑糟醅單獨起堆糖化。6口試驗窖池中剩余糟醅均按上述方法處理，直至所有糟醅完成起堆。糖化結束后同時下窖發酵（對應編號Ⅰ組1 號窖池、Ⅰ組2 號窖池、Ⅰ組3 號窖池，Ⅱ組1 號窖池、Ⅱ組2 號窖池、Ⅱ組3 號窖池）。生產過程中，確保每甑底鍋水用量、上甑操作、上甑時間、蒸餾氣壓、蒸餾時間等一致。

第5 輪次發酵結束后，6 口試驗窖池同時開窖，按正常生產取酒，各窖池所取原酒單獨貯存。

1.2.2 糟醅理化指標測定

樣品準備：取6 口窖池第4 輪次第13 甑（中層）上甑前混合樣糟醅；Ⅰ、Ⅱ組第5 輪次第13 甑加曲后、入池前糟醅及出池中層糟醅混合樣。

測定方法：利用酸堿滴定法測定糟醅酸度，恒重法測定水分，斐林試劑法測定殘糖和淀粉，試劑配制和測定方法參見GB/T 10345《白酒分析方法》[4]。

1.2.3 糖化及發酵溫度的測定

糖化溫度的測定：在糖化堆距離地面90 cm±4 cm，深度20 cm±3 cm 處隨機選取4 個位置（取平均值為腰部溫度）及頂部向下、底部向上20 cm±3 cm插入食品級不銹鋼測溫桿，每隔12 h測量記錄一次5個不同位置的溫度。

窖內發酵溫度測定：每天上午同一時間段采用食品級不銹鋼電子測溫桿測定窖內上、中、下6 個點位的溫度，每隔24 h測量記錄一次溫度。

1.2.4 色譜分析（毛細管）

酒樣制備：對第5 輪次的Ⅰ、Ⅱ組6 口窖池單獨分層取酒，并對同一組窖面、窖中、窖底綜合酒樣進行香味成分的測定。

色譜柱：KB-ALCOHOL 毛細管柱，20 m×0.53 mm（內徑）×0.6 μm（壁厚）或性能相當色譜柱。載氣：高純氮，流速1.6 mL/min，分流比20∶1，尾吹30 mL/min。氫氣：流速40 mL/min。空氣：流速400 mL/min。檢測器溫度：260 ℃。進樣器溫度：240 ℃。柱溫：初始溫度為50 ℃，恒溫8 min，以6 ℃/min 的速度升溫至160 ℃，繼續恒溫5 min。進樣體積：10.0 μL。

1.2.5 糟醅微生物測定

1.2.5.1 糟醅樣品準備

取第4 輪次出池中層糟混合樣（即6 口窖池第13 甑上甑前混合樣，編號A3），Ⅰ、Ⅱ組第5 輪次第13 甑加曲后、入池前糟醅及出池中層糟醅混合樣：Ⅰ組第13 甑加曲后的混合樣（編號A1），Ⅱ組第13甑加曲后的混合樣（編號B2）；Ⅰ組入池混合樣（編號A2），Ⅱ組入池混合樣（編號B1）；第5 輪次Ⅰ組窖池中層混合樣（編號A4），Ⅱ組窖池中層混合樣（編號B3）。

1.2.5.2 微生物組總DNA提取與PCR擴增

本實驗微生物組總DNA 提取按照omega M5635-02 說明書進行，抽提完成的DNA 通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行分子大小判斷，再利用紫外分光光度計對DNA 進行定量，測定其OD260/280值及其含量。

PCR擴增操作：將PCR反應所需的成分配置完后，在PCR 儀上于98 ℃下預變性30 s，使模板DNA充分變性，然后進入擴增循環。在每一個循環中，先于98 ℃下保持15 s 使模板變性，然后將溫度降到50 ℃，保持30 s，使引物與模板充分退火；在72 ℃下保持30 s，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個循環。重復這樣的循環25～27 次，使擴增的DNA 片段大量累積。最后，在72 ℃下保持5 min，使產物延伸完整，4 ℃保存。

1.2.5.3 DNA文庫建立與測序分析

擴增結束后，對擴增結果進行2%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片段然后用Axygen 凝膠回收試劑盒回收目的片段，利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 對PCR 產物在Microplate reader (BioTek,FLx800)上進行定量。再利用Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 進 行DNA 建庫，文庫經Agilent Bioanalyzer 機器用Agilent High Sensitivity DNA Kit 2100 質檢合格后，利用Illumina公司的NovaSeqPE250測序平臺進行高通量測序。

1.2.5.4 生物信息學分析

首先對高通量測序獲得的原始下機數據根據序列質量進行初步篩查，對問題樣本進行重測、補測；通過質量初篩的原始序列按照index 和Barcode[5]信息，進行文庫和樣本劃分，并去除barcode[5]序列，獲得高質量的Tags 序列。利用QIIME2 dada2[6]進行序列去噪或OTU聚類測定、生物學組成分析等。

2 結果與分析

2.1 添加醬香功能菌對醬酒發酵過程中溫度的影響

2.1.1 糖化堆積溫度變化

按方法1.2.3 對Ⅰ、Ⅱ組糖化堆底部、腰部、底部的溫度進行測定，并記錄其溫度變化，不同部位平均溫度變化如圖1所示。

圖1 糖化堆積溫度圖

從圖1 可以看出：糖化過程中，Ⅰ、Ⅱ組糖化堆溫度變化均呈現“前期升溫慢、中期升溫快、后期穩定”的規律；同一糖化堆不同部位糖化溫度比較，Ⅰ、Ⅱ組均表現為：頂部＞腰部＞底部；同點位不同堆糖化溫度比較，在糖化前期（前48 h）Ⅰ組（試驗組）糖化堆平均溫度略高于Ⅱ組（常規組）糖化堆平均溫度，48 h后兩者基本持平。

糖化前期，糖化堆具有一定含氧量，Ⅰ組由于添加醬香功能菌，其中微生物數量和種類多于Ⅱ組，糖化過程得到促進，故其糖化溫度略高于Ⅱ組。隨著糖化時間的推移，含氧量降低，溫度升高，大多產酒菌生長在后期受到抑制，微生物活躍度與Ⅱ組基本持平，溫度無較大差異。

2.1.2 窖內溫度

按方法1.2.3 對Ⅰ、Ⅱ組發酵窖池內部窖內上、中、下6 個點位進行溫度測定，并記錄其溫度變化，每組所測溫度平均值結果如圖2所示。

圖2 窖內發酵溫度圖

從圖2 可以看出，同組窖池內發酵溫度為窖中＞窖底＞窖面。兩組窖池在同一位置、相同發酵天數下，Ⅰ組窖池平均溫度略高于Ⅱ組窖池平均溫度；整體而言，添加醬香功能菌的窖池比常規窖的溫度略高1 ℃。

2.2 添加醬香功能菌對糟醅理化的影響

糟醅理化指標檢測是醬酒生產過程中監測并判斷糟醅質量的重要手段，是生產任務順利完成的保障[7]。對各樣品糟醅理化指標進行檢測，檢測結果如表1所示。

表1 糟醅理化指標

從表1 可以看出，在第5 輪次生產中，水分增加，酸度降低，糟醅水分與酸度呈負相關。經30 d發酵后，Ⅰ組糟醅淀粉利用率為3.34%，Ⅱ組糟醅淀粉利用率為2.52%，說明試驗組淀粉分解能力略高于常規組；Ⅰ組糟醅糖分利用率為1.04%，較Ⅱ組糟醅糖分利用率略高0.11%。綜上，Ⅰ組（試驗組）的糟醅淀粉及糖分利用率略高于Ⅱ組（常規組）。

2.3 樣品微生物多樣性分析

2.3.1 樣品測序數據處理

采用Illumina 平臺對群落DNA 片段進行細菌16S rRNA V3—V4 區序列測序測定，選擇Vsearch[8]方法對樣本序列進行分析，結果如表2 所示。7 個樣品合計測得原始序列數為559716 條，過濾后得到有效序列總量為460626 條，7 組樣品Q20 值（質量值大于或等于00 的堿基占總堿基數的百分比）均大于94%，說明數據質量較高。

表2 樣品測序數據處理統計表

2.3.2 細菌菌群Alpha多樣性分析

在97%相似度下，針對460626 條具有代表性序列進行聚類分析，并利用QIIME 劃分OTU，同時以Alpha 多樣性指標中的Chao1 指數、Observed species 指數、Shannon 指數等對樣品序列文庫進行分析。以Chao1[9]和Observed species 指數表征豐富度，以Shannon[10]指數表征多樣性，結果如表3所示。

表3 樣品Alpha多樣性指數表

由表3 可看出，各樣品OTU 數量分別為1707、1516、207、856、1250、874、216，合計OTU 數量為6626個。對第4輪次出池糟和第5輪次各樣品進行Alpha 多樣性分析，第5 輪次生產過程中：A1 中Chao1 與Observed species 指數最大，豐富度最高，而B2豐富度最低；樣品A2中Shannon指數最大，多樣性最高，A3 多樣性最低。由此可見，在醬酒生產過程中添加2‰醬香功能菌，能夠提升細菌菌落的豐富度和多樣性。

2.3.3 樣品間屬水平群落結構組成分析

在OTU 劃分基礎上，選取OTU 中豐度最高的序列作為代表序列，與微生物參考序列數據庫比對進行分類學鑒定，各分類水平所含分類單元數量計算完成后，調用QIIME2 軟件中“qiime taxa barplot”命令，進行樣品屬水平組成結構繪圖，結果如圖3所示。

從圖3 可以看出，一共獲得10 個可鑒定的菌屬和一些無法歸類的菌屬。10 個菌屬分別為Lactobacillus、Kroppenstedtia、Halomonas、Sphingomonas、Escherichia-Shigella、Acinetobacter、Bacillus、Thermoactinomyces、Pelagibacterium、Weissella，將相對含量≥1%的屬定義為優勢細菌屬。上甑前糟醅（A3）的主要優勢菌為Lactobacillus（91.23%）和Escherichia-Shigella（3.1%）。

圖3 屬水平各樣本細菌菌落結構組成差異

經蒸餾取酒后Ⅰ組糟醅（加入2 ‰醬香功能菌）加曲后（A1）優勢菌屬為：Lactobacillus（3.78%）、Kroppenstedtia（27.59%）、Halomonas（1.12%）、Sphingomonas（4.49%）、Escherichia-Shigella（2.63%）、Acinetobacter（1.75%）、Bacillus（5.13%）、Thermoactinomyces（4.85%）、Weissella（16.01%），添加醬香功能菌后優勢菌屬增加7 個，其中，Lactobacillus和Escherichia-Shigella含量呈下降趨勢，其余細菌大幅增加。所有糟醅加曲完成后，堆積糖化96 h 后（A2），優勢菌屬為：Kroppenstedtia（27.97%）、Halomonas（6.66%）、Sphingomonas（5.65% ）、Acinetobacter（6.69% ）、Bacillus（10.77%）、Thermoactinomyces（4.92%）、Pelagibacterium（5.69%），在糖化環節，Lactobacillus和Escherichia-Shigella生長受到抑制，其余優勢菌種均得到有效增長。經入池發酵后，優勢菌種僅剩Lactobacillus（99.72%）。

Ⅱ組糟醅加曲后（B2）優勢菌種為：Kroppenstedtia（23.76%）、Halomonas（5.09%）、Sphingomonas（9.44%）、Escherichia-Shigella（14.49%）、Acinetobacter（10.26%）、Bacillus（2.19%）、Thermoactinomyces（7.31%）、Pelagibacterium（4.75%）。經堆積糖 化96 h 后（B1）優勢菌種為：Kroppenstedtia（18.7%）、Halomonas（11.59%）、Sphingomonas（2.73%）、Bacillus（1.74%）、Thermoactinomyces（2.27%）、Pelagibacterium（7.58%），Ⅱ組在糖化過程中，Escherichia-Shigella和Acinetobacter生長被抑制，Halomonas和Pelagibacterium含量增加，其余優勢菌均呈下降趨勢。窖內發酵結束后，優勢菌種為Lactobacillus（94.49%）、Kroppenstedtia（1.24%）。

綜上所述，在醬酒生產中加入醬香功能菌能有效提升細菌屬優勢菌種類和相對含量，并能促進優勢菌種在生產過程中不斷繁殖生長。

2.4 添加醬香功能菌對酒質的影響

2.4.1 原酒風味物質分析

將兩組窖池糟醅在相同蒸汽壓力下分層取酒，對所取各組原酒酒樣進行色譜毛細管柱分析，其結果詳見表4。

表4 各組原酒主要理化指標 (mg/100 mL)

從表4 可以看出，窖池中層的原酒的吡嗪類含量較窖面、窖底略高；其中Ⅰ組窖池窖面、窖中、窖底的總酯、四甲基吡嗪、三甲基吡嗪的平均含量分別高于Ⅱ組相同部位。從整體指標數據看，Ⅰ組窖池（試驗組）酒樣理化指標略優于Ⅱ組窖池酒樣（常規組）。

2.4.2 感官評定

將各組糟醅在相同蒸汽壓力下取酒，并送樣進行感官嘗評，由10 名專業的品酒師組成暗評小組，評價方法參照中國酒業協會團體標準《固態法醬香型白酒原酒》中附錄A[11]。品評結果如表5所示。

表5 各組酒樣感官品評表

從表5 可以看出，通過Ⅰ組和Ⅱ組各酒樣感官嘗評，結果表明，Ⅰ組窖池產酒上、下層與Ⅱ組窖池酒樣感官風格基本一致，中層酒樣Ⅰ組窖池略優于Ⅱ組窖池原酒。

3 結論

在第5 輪次醬酒生產中,選定6 口窖池開展醬酒生產添加醬香功能菌試驗，以探索功能菌對醬酒生產的影響，圍繞糟醅糖化溫度、發酵溫度、糟醅理化指標、微生物菌落及多樣性、原酒理化與感官等方面分析，發現：加入醬香功能菌的糖化堆在堆積前期（前48 h）溫度略高于常規曲，48 h 后兩者基本持平，在窖池發酵溫度上比常規窖的溫度略高1 ℃；其糟醅淀粉利用率和糖分利用率高于常規；微生物豐度和優勢菌群類別和含量有所提升；風味物質含量表現略優，中層酒感官略優于常規。

本研究中通過在第5 輪次醬酒生產中添加醬香功能菌試驗，能一定程度提高細菌屬優勢菌種類和含量，促進優勢菌群繁殖生長，提升醬酒風味指標和原酒品質。因本研究只是小范圍試驗，全面性不足，該結果僅供參考，今后還需進一步深入探索。