庫德畢赤酵母FJZ固態發酵產乙酸乙酯工藝的優化

韓 英，李惠源，賈麗艷，甄 攀，高文靜，王軍艷

（1.山西杏花村汾酒廠股份有限公司技術中心，山西汾陽 032209；2.山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷 030801；3.山西省白酒生物工程研究生教育創新中心，山西太谷 030801）

傳統清香型白酒是以高粱為原料，大曲為發酵劑，通過網羅環境中的微生物，采用“清蒸二次清，地缸固態發酵，甑桶蒸餾”工藝生產而成，具有“入口綿，落口甜，清香不沖鼻，飲后有余香”的特點[1]，在國內外深受消費者的喜愛。乙酸乙酯是清香型白酒的主要風味物質之一，其在白酒中的含量及與其他風味物質的比例，對于清香型白酒的風格具有重要影響[2]。由于自然環境對清香型白酒中乙酸乙酯的形成具有一定的影響，使得乙酸乙酯在清香型白酒中的含量及比例具有一定的不穩定性，影響清香型白酒的品質[3]。微生物是白酒發酵的核心。從自然環境中分離高產乙酸乙酯的菌株，并強化應用于清香型白酒的生產中，對于穩定清香型白酒中乙酸乙酯含量，提升清香型白酒品質具有一定的意義。

山西杏花村是以汾酒為代表的傳統清香型白酒的主產地，具有悠久的釀造歷史[4]，自然環境中存在優良的微生物菌種資源。為了挖掘山西杏花村本土環境中的功能性微生物，課題組從2015 年開始從杏花村汾酒廠分離篩選傳統清香型白酒酒醅及生產環境中的功能性菌株，期間，從傳統清香型白酒的酒醅中分離篩選獲得1 株高產乙酸乙酯的菌株，經鑒定為庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），命名為庫德畢赤酵母FJZ。該菌株具有良好的生物學特性和環境耐受性[5]，具有應用于傳統清香型白酒發酵生產的潛能。為此，課題組在前期研究的基礎上，以高粱為發酵基質，采用固態發酵技術，以乙酸乙酯和總酯含量為檢測指標，通過單因素及響應面試驗優化發酵工藝，確定庫德畢赤酵母FJZ 固態發酵產乙酸乙酯發酵工藝條件，為該菌株在白酒釀造過程中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 菌株

庫德畢赤酵母FJZ（簡稱菌株FJZ）：分離自山西杏花村汾酒廠新鮮酒醅中。

1.1.2 培養基

YEPD液體培養基：蛋白胨20 g、酵母膏10 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 L。固體培養基加20 g瓊脂[6]。

發酵用高粱固態培養基：將1 L 去離子水加入到500 g 粉碎后的高粱中浸泡24 h，再經過濾后蒸煮2 h，晾涼至60 ℃后，加入適量糖化酶，消化2 h，制成固態發酵培養基，滅菌備用[7]。

1.1.3 試劑及耗材

蛋白 胨，葡 萄糖，CaCl2，(NH4)2SO4，KH2PO4，MgSO4·7H2O，酵母膏，瓊脂，糖化酶(3000 U/g)，液化酶(20000 U/g)，乙酸乙酯（分析純），以上試劑均購買于北京索萊寶公司。

1.1.4 儀器設備

PR-CJT-4 超凈工作臺，上海普瑞斯儀器有限公司；YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；GNP-9160 電熱恒溫培養箱，上海精宏試驗設備有限公司；BS2010S電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；TopPette移液槍，濟南東儀試驗室設備有限公司；85-2A 磁力攪拌器，精鑿科技（上海）有限公司；pHSJ-4A pH計，美國奧立龍公司；DL-1 萬用電爐，北京市永光明醫療儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素試驗的設計

（1）發酵溫度對菌株FJZ產酯能力影響的測定

將菌株FJZ 以3.0%接種量接入發酵用高粱固態培養基中，分別在24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃和36 ℃條件下發酵7 d，測定其總酯和乙酸乙酯含量，探究發酵溫度對菌株FJZ產酯能力的影響。

（2）發酵時間對菌株FJZ產酯能力影響的測定

將菌株FJZ 以3.0%接種量接入發酵用高粱固態培養基中，30 ℃分別發酵5 d、7 d、9 d、11 d、13 d，測定其總酯和乙酸乙酯含量，探究發酵時間對菌株FJZ產酯能力的影響。

（3）接種量對菌株FJZ產酯能力影響的測定

將菌株FJZ 分別以3%、5%、7%、9%和11%的接種量接入發酵用高粱固態培養基中，30 ℃條件下發酵7 d，測定其總酯和乙酸乙酯含量，探究接種量對菌株FJZ產酯能力的影響。

（4）輔料添加量對產酯能力影響的測定

將菌株FJZ 以3.0%接種量接入發酵用高粱固態培養基中，分別按12%、14%、16%、18%和20%的比例加入谷糠，30 ℃條件下發酵7 d，測定其總酯和乙酸乙酯含量，探究輔料添加量對菌株FJZ產酯能力的影響

1.2.2 響應面試驗設計

根據單因素試驗確定影響產酯能力的顯著因素，以總酯和乙酸乙酯含量作為響應值設計響應面試驗，獲得最優發酵工藝條件。

1.2.3 理化指標的測定

（1）總酯含量的測定：采用堿皂化回流法[8]。

（2）乙酸乙酯含量的測定：參考魏志陽[9]的方法測定樣品中乙酸乙酯含量，對樣品前處理方法略作修改，即稱取50.00 g樣品于燒杯中，加入300 mL體積分數為10%乙醇浸泡0.5 h，期間，每隔10 min 攪拌1 次，過濾，濾渣再用體積分數為10%的乙醇反復清洗過濾，定容至1000 mL，獲得液相檢測用品，備用。

1.2.4 數據的處理

利用Origin8.5 軟件和Design Expert 10 進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 發酵溫度對菌株FJZ產酯能力的影響（圖1）

圖1 發酵溫度對產酯能力的影響

由圖1 可知，隨著發酵溫度的升高，庫德畢赤酵母FJZ 的產酯能力也發生相應的變化，酯類濃度呈先上升后下降的趨勢，且乙酸乙酯與總酯含量變化趨勢一致，呈正相關性。當溫度在24～30 ℃范圍內時，乙酸乙酯及總酯含量逐漸上升；當培養溫度在30 ℃時，總酯及乙酸乙酯含量都達到了最大值，分別為（7.98±0.17）g/100 g 和（1.38±0.021）g/kg；當發酵溫度在30 ℃以上時，乙酸乙酯及酯類含量呈下降趨勢。以上結果表明，菌株FJZ 在30 ℃時產酯能力最佳，高溫對菌株FJZ 產乙酸乙酯能力具有抑制作用。因此，菌株FJZ 固態發酵產乙酸乙酯的最佳發酵溫度為30 ℃。

2.2 發酵時間對菌株FJZ產酯能力影響（圖2）

由圖2 可知，隨著發酵時間的延長，酯類濃度呈先上升后緩慢下降的趨勢。當發酵時間為7 d時，總酯含量和乙酸乙酯含量都達到最大值，分別為（7.02±0.02）g/100 g 和（1.35±0.013）g/kg，酒醅中總酯及乙酸乙酯含量增加了3 g/100 g 和1.08 g/kg，分別提高了75%和400%。因此，菌株FJZ 固態發酵產乙酸乙酯的最佳發酵時間為7 d。

圖2 發酵時間對產酯能力的影響

2.3 接種量對菌株FJZ產酯能力影響（圖3）

圖3 接種量對產酯能力的影響

接種量對高粱培養基中菌株發酵周期有很大影響，接種量過低會使菌株生長緩慢，導致代謝速率低，產酯能力不足[10]。而接種量過高，過量的菌株生長所消耗的底物過多，造成產酯所需的營養物質嚴重不足，導致菌株產酯能力下降，使酯類濃度降低。由圖3可知，隨著接種量的變化，菌株FJZ在高粱培養基中的酯類濃度呈現先上升后下降的趨勢。當接種量為3%時，總酯和乙酸乙酯濃度都達到最大值，分別為（8.24±0.07）g/100 g 和（1.33±0.01）g/kg，分別比空白對照組提高了104%和850%；當接種量大于3%時，總酯含量呈現緩慢下降的趨勢。因此，菌株FJZ 固態發酵產乙酸乙酯的最佳接種量為3%。

2.4 輔料添加量對菌株FJZ產酯能力影響（圖4）

圖4 輔料添加量對產酯能力的影響

白酒固態發酵中，輔料的填充，賦予酒醅一定的疏松度，使得酒醅中具有微量的氧氣，這有利于好氧或兼性厭氧微生物的生長，促進香味成分的生成；然而，輔料用量過大，透氣性過好，也會導致酒醅升溫和生酸過快，影響發酵和風味物質的形成[11-12]。由圖4 可知，隨著輔料添加量的增加，乙酸乙酯及酯類含量呈先上升后下降的趨勢。當輔料添加量為4%時，總酯和乙酸乙酯含量都達到最大值，分別為（8.11±0.08）g/100 g 和（1.28±0.014）g/kg。因此，菌株FJZ 固態發酵產乙酸乙酯的最佳輔料添加量為4%。

通過對菌株FJZ 的發酵溫度、發酵時間、接種量、輔料添加量進行單因素水平試驗，探究各因素水平對產乙酸乙酯能力以及總酯含量的影響，結果表明，發酵溫度、發酵時間、接種量、輔料添加量對于酒醅中總酯和乙酸乙酯的形成具有一定的影響。

2.5 響應面法試驗結果及方差分析

通過單因素試驗，篩選出4 個影響總酯和乙酸乙酯變化的顯著因子，為進一步優化工藝，對發酵時間（A）、發酵溫度（B）、接種量（C）、輔料添加量（D）4 個因素進行優化試驗設計（表1），結果見表2。

表1 響應面分析的因素水平

表2 響應面試驗設計與結果

對應用Design Expert 8.0.6.1 軟件設計的響應面試驗結果進行多元化回歸擬合分析，得出該菌株固態發酵的總酯含量（Y1）與發酵時間（A）、發酵溫度（B）、接種量（C）、輔料添加量（D）四因素變量的二次方程模型為：

Y1=8.11-0.31*A-0.19*B-0.27*C-0.45*D-0.37*A*C+0.17*A*D+0.07*B*C+0.043*B*D +0.25*C*D-1.32*A2-1.15*B2-0.37*C2-0.48*D2。

乙酸乙酯含量（Y2）與A、B、C、D四因素的二次方程為：

Y2=1.26+0.019*A-0.072B+0.11*C+0.067*D+0.060*AB-0.065*AC+0.023*AD+5.000E-003*BC-0.013*BD+0.050*CD-0.14*A2-0.20*B2-0.27C2-0.19*D2。

根據表3 方差分析可知，回歸模型P 模型＜0.0001＜0.01，表明該響應面回歸模型差異極顯著。失擬項P=0.0502/0.0523＞0.05，差異不顯著，說明試驗誤差較小，模型預測結果可靠。回歸方程R2=0.9931/0.9986，表明四因素與總酯和乙酸乙酯含量之間的多元回歸關系顯著，試驗設計的可靠性極佳，因此，可以利用該回歸方程預測上述因素對菌株FJZ 產酯工藝的優化。由方差分析結果可知，接種量A，發酵溫度B，接種量C，輔料添加量D 對高粱固態培養基中總酯含量和乙酸乙酯含量的影響都極顯著。

表3 響應面試驗方差分析

2.6 發酵條件驗證試驗

根據響應面試驗結果，最終確定菌株FJZ 最佳產酯發酵條件為：發酵時間6.92 d、發酵溫度29.67 ℃、接種量3.08%、輔料添加量3.89%。根據實際情況，對預測最佳工藝參數進行微調，最終實際工藝參數為發酵時間7 d，發酵溫度30 ℃，接種量3%，輔料添加量4%，為驗證模型預測的工藝參數可靠性，在此條件下進行驗證試驗，以傳統清香型白酒正常發酵酒醅為對照，重復3 組平行試驗，測得高粱固態發酵培養基中總酯含量和乙酸乙酯含量分別為（8.13±0.08）g/100 g 和（1.30±0.014）g/kg，實際數值與模型預測數值基本一致，故該模型基本準確。

傳統清香型白酒大米查、二米查各發酵28 d 酒醅中的乙酸乙酯含量在0.3～0.5 g/kg 之間，而利用以上模型，菌株FJZ 所產乙酸乙酯可以達到（1.30±0.014）g/kg，生成量約為傳統清香型白酒發酵酒醅中乙酸乙酯的2.5～4 倍，以上結果表明，菌株FJZ具有提升傳統清香型白酒中乙酸乙酯含量的能力。

3 結論

菌株FJZ 高粱固態發酵產乙酸乙酯最佳工藝條件為：發酵溫度30 ℃，發酵時間7 d，接種比例3%，輔料添加量4%。該條件下高粱固態發酵培養基中總酯含量可達（8.13±0.08）g/100 g，乙酸乙酯含量達（1.30±0.014）g/kg，在高粱中產乙酸乙酯能力強。菌株FJZ 具有強化應用于傳統清香型白酒生產中提升乙酸乙酯含量的能力。以上研究為菌株FJZ 在白酒及其他釀造類食品中的開發利用奠定了理論和應用基礎。