許氏平鲉(Sebastes schlegelii)卵子發(fā)生及妊娠過程中雌激素、芳香化酶及其受體的變化規(guī)律*

徐小杰 王學穎 周 莉 劉清華① 李 軍①

(1. 中國科學院海洋研究所實驗海洋生物學重點實驗室 青島 266071; 2. 中國科學院海洋大科學研究中心 青島 266071;3. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋生物學與生物技術功能實驗室 青島 266237; 4. 中國科學院大學 北京100049)

雌二醇是魚類卵巢分泌的主要的性類固醇激素之一, 在脊椎動物卵子發(fā)生、性別分化、卵黃形成、生理免疫以及中樞神經系統(tǒng)調節(jié)等生理過程中發(fā)揮重要的作用(Lubzenset al, 2010; McCarthy, 2010; Eicket al, 2011)。雌二醇的合成需要膜細胞層和顆粒層共同完成。首先膽固醇進入到膜細胞層, 膽固醇被CYP11A1 酶催化后, 孕烯醇酮和孕酮進行17a-羥基化, 再分別通過C21、17-羥基途徑先后得17a-羥基孕酮和雄烯二酮。然后雄烯二酮被轉化為雄激素被轉運到顆粒層中, 在芳香化酶(P450arom)的作用下被轉化成雌二醇(Milleret al, 1997; Kagawa, 2013)。

芳香化酶由cyp19基因編碼, 屬于細胞色素P450家族, 是催化雄激素向雌激素轉化的一種關鍵酶。在硬骨魚中, 芳香化酶基因存在兩種亞型: P450arom A和450arom B, 分別主要表達于性腺和腦中, 被稱為性腺芳香化酶和腦芳香化酶(Tchoudakovaet al, 1998)。雌激素需要與分布在細胞膜和細胞核內的雌激素受體(estrogen receptor, ER)結合才能發(fā)揮作用(Woodset al,2009)。在目前的硬骨魚類的研究中, 人們已經證實,雌激素與雌激素受體結合可以起到促進卵黃蛋白原產生的作用, 從而維持卵母細胞的正常發(fā)育(Flouriotet al, 1996; Sabo-Attwoodet al, 2004; Nelsonet al, 2010)。并且在對大黃魚的研究中, Chen 等(2015)推測ERα 和ERβ1 可能參與卵巢發(fā)育和排卵等過程。

許 氏 平 鲉(Sebastes schlegelii) 隸 屬 于 鲉 形 目(Scorpaeniformes)、鲉 科(Scorpaenidae)、 平 鲉 屬(Sebastes), 是一種重要的海洋經濟魚種, 廣泛分布于中國、日本和韓國海域。許氏平 鲉營胎生繁殖, 且經過漫長的卵黃積累期和妊娠期, 這一特殊的生殖方式使得它受到了國內外學者的廣泛關注。Mori 等(2003)、Shi 等(2011)、Kwon 等(2013) 對 許氏平 鲉卵巢發(fā)育過程中雌二醇的含量變化進行過一定的研究, 但是他們對于處于妊娠期的許氏平 鲉的研究較少。本文選取了II、III 至孵化前共7 個發(fā)育期, 通過分析cyp19a和Era在許氏平 鲉卵巢上的定位、cyp19a和cyp19bmRNA 在不同卵巢發(fā)育時期及不同組織中的表達以及不同發(fā)育期的卵巢中雌二醇含量變化, 分析許氏平 鲉卵巢發(fā)育、卵黃積累及其妊娠過程中從卵巢組織結構變化、雌激素水平, 芳香化酶及雌激素受體的表達規(guī)律, 為深入解析許氏平 鲉胎生生殖特性積累資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用許氏平 鲉(Sebastes schlegelii)來自青島南山市場, 從9 月到次年5 月每月購買; 所用大菱鲆從威海圣航水產科技有限公司獲得, 從3 月到7 月每月采集。取樣之前, 使用麻醉劑(MS-222, Sigma, St.Louis, MO)將所有魚麻醉, 然后收集每條魚的腦、心臟、鰓、腎臟、肝臟、脾臟、腸道以及二分之一的卵巢等組織保存在液氮中用于后續(xù)的分子實驗。四分之一的卵巢組織在Bouin’s 液中固定24 h, 然后置換到70%的酒精中保存用于后續(xù)的組織學觀察; 另外四分之一的卵巢組織在多聚甲醛中固定24 h, 然后置換到70%的酒精中保存用于后續(xù)的原位雜交實驗。除此之外, 從靜脈中抽取血液樣品到抗凝管中, 4 °C 保存24 h 后16 000g離心10 min, 將上清液保存在–80 °C用于后續(xù)的激素測定。

1.2 RNA 提取和cDNA 合成

將保存在液氮中組織樣品取出, 使用 SPARK easy tissue/cell RNArapid extraction kit (SparkJade,China)試劑盒并參考其說明書進行RNA 的提取。提取后進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測, 并在260 nm 和280 nm 的紫外光譜下測定濃度, 然后使用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa, Japan)進行反轉錄, 使終濃度統(tǒng)一為1 000 ng/μL。然后稀釋至100 ng/μL, 置于–20 °C 中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 組織學

固定好的卵巢樣品經過梯度酒精脫水(70%, 80%,85%, 90%, 95%, 100%)、復水環(huán)節(jié)被包埋到石蠟中。修整蠟塊后, 用Leica 2235 切片機進行連續(xù)切片, 切片厚度為5 μm。然后進行蘇木精-伊紅(H.E)染色, 染好色的切片置于NikonENi (Japan)下觀察處于不同發(fā)育期的卵巢的組織形態(tài), 文章中卵母細胞的卵子發(fā)育過程參考史丹等(2011)和Grier 等(2009)的研究分為五個時期。

1.4 原位雜交

Era和cyp19a的cDNA 序列從本實驗室的轉錄組數(shù)據(jù)中獲得。第一輪PCR 擴增以稀釋后的濃度為100 ng/μL 卵巢組織的cDNA 作為模板, 上下游分別使用F 和R 引物(Era-F/R,cyp19a-F/R)。第二輪擴增以第一輪擴增的產物為模板, 上下游分別使用F 和R-T7 引物(Era-F/ISH-RT7,cyp19a-F/ISH-RT7), 得到的產物進行純化后, 用DIG RNA Labeling Kit (Roche,Mannheim, Germany)合成探針, 進行原位雜交實驗。表1 中列出了合成探針過程中所用的引物。

表1 引物名稱及序列Tab.1 The names of the primers and the sequences

1.5 半定量(RT-PCR)

以采集到的體節(jié)期的腦、心臟、鰓、腎臟、肝臟、脾臟、腸道和卵巢以及整個發(fā)育期的卵巢樣品分別作為模板, 針對兩個基因設計不同的引物(cyp19a-F/R,cyp19b-F/R), 并選用18S 作為內參照進行一同進行PCR 擴增, 所用引物同樣列在表1 中。PCR 擴增體系為: 模板cDNA 0.5 μL、KOD ONE 酶12.5 μL、上下游引物各0.75 μL、無菌水10.5 μL。反應程序: 98 °C反應10 s, 68 °C 反應10 s, 35 循環(huán)。

1.6 激素測定

將采集的血清樣品從–80 °C 冰箱中取出, 按照Iodine [125I] Radioimmunoassay (RIA) kits (Beijing,China) 的 說明書對許氏平 鲉雌激素的含量進行測定。該方法與雌激素的結合率高, 對其他甾體的交叉反應性低, 對大多數(shù)循環(huán)甾體的交叉反應性小于0.1%。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Spss22.0 中的Duncan’s 法對實驗數(shù)據(jù)進行處理和分析, 當P<0.05 時認為差異顯著。

2 結果

2.1 許氏平鲉卵巢在整個發(fā)育期的形態(tài)變化

見圖1。 許氏平 鲉的卵巢中含有豐富的間質細胞,當卵巢發(fā)育至II 期的時候, 卵巢內以2 時初級相卵母細胞為主。2 時相初級卵母細胞體積較小且形狀不規(guī)則, 呈多邊形, 胞質呈強嗜堿性, 核質均勻且著色較淺。此時的卵母細胞沒有發(fā)育出清晰的濾泡層結構,細胞外僅有一層濾泡細胞結構。一般在11 月的時候,許氏平 鲉的卵巢發(fā)育至III 期, 此時卵巢內以3 時相卵母細胞為主。3 時相卵母細胞被生殖上皮包圍, 呈圓球形, 濾泡細胞發(fā)展成2 層。濾泡細胞包繞著卵母細胞, 形成獨立的卵泡結構。卵母細胞皮質部分出現(xiàn)體積大于皮層小泡的油球, 以后油球數(shù)目逐漸增多。雄魚與雌魚的交配就發(fā)生在這一階段, 交配后, 精子進入到雌魚的卵巢腔內。當卵巢發(fā)育到IV 期的時候,一般是1 月, 卵巢內充滿4 時相卵母細胞。4 時相卵母細胞較3 時相卵母細胞體積進一步增大, 卵黃顆粒數(shù)量迅速增多, 卵黃顆粒體積迅速增大, 濾泡層被壓縮變窄。當卵巢內以5 時相卵母細胞為主時, 卵巢發(fā)育處于V 期(史丹等, 2011)。經過了漫長的卵黃積累過程, 在這一時期, 卵母細胞已充分發(fā)育成熟, 細胞內充滿成熟卵黃顆粒, 部分卵黃顆粒開始融合, 濾泡層破裂。卵子受精后, 顆粒層脫離透明帶(ZP), 與周圍的膜細胞層混合, 形成屏障。隨后, 它們迅速遷移、侵入周圍組織并迅速擴張, 形成濾泡胎盤以支持胚胎發(fā)育。在妊娠期早期, 隨著胚胎的發(fā)育, 濾泡胎盤進一步發(fā)育和擴張。當胚胎發(fā)育至囊胚期的時候, 胚胎周圍包繞著豐富的呈折疊狀的濾泡胎盤。隨著胚胎的繼續(xù)發(fā)育, 濾泡胎盤逐漸變得疏松。當胚胎發(fā)育到體節(jié)期的時候, 濾泡胎盤結構較囊胚期疏松, 到了孵化前期, 視野內只能觀察到極少的濾泡胎盤的存在。

圖1 許氏平 鲉卵巢在整個發(fā)育期的組織學觀察Fig.1 Histology of the black rockfish ovary development

2.2 cyp19a 和Era 在許氏平 鲉卵巢中的定位

當許氏平 鲉的卵巢發(fā)育到III 期和IV 期的時候,cyp19a在濾泡層上有信號, 并且特異的表達在顆粒細胞上(圖2a, 2b)。在V 期卵巢中可以觀察到,cyp19a的信號變得極其微弱(圖2c), 在囊胚期則觀察不到信號(圖2d)。Era在III 期和IV 期卵巢中檢測不到信號(圖2e, 2f), 當卵巢發(fā)育至V 期的時候, 在5 時相卵母細胞的濾泡層上可以觀察到非常明顯的信號, 除此之外,濾泡層外面的基質細胞也可以檢測到信號表達(圖2g)。在囊胚期,Era的陽性信號出現(xiàn)在濾泡胎盤上并且依然非常明顯(圖2h)。圖2(a1)為正義探針的雜交結果。

圖2 cyp19a 和Era 的原位雜交結果Fig.2 In situ hybridization results of cyp19a and Era

2.3 cyp19a 和cyp19b mRNA 在不同組織中及不同卵巢發(fā)育時期的表達

見圖3。在同一條魚的不同組織中,cyp19a僅在卵巢和腦中有表達, 且在卵巢中的表達量明顯高于腦。cyp19b在卵巢、脾臟、腦和肝臟中都有表達, 其中腦的表達量最高, 卵巢、脾臟和肝臟中微弱表達。在許氏平 鲉整個卵巢發(fā)育時期,cyp19a在III 期、IV期、V 期、囊胚期和體節(jié)期均有表達, III 期、IV 期和體節(jié)期的表達要強于V 期和囊胚期, 孵化前期沒有表達。cyp19b在整個卵巢發(fā)育過程中只在III 期、IV期和體節(jié)期有表達, 且體節(jié)期的表達強于IV 期, III期的條帶極其微弱, 在V 期、囊胚期和孵化前期沒有表達。并且整體來看, 在同一時期,cyp19a的表達要強于cyp19b。

圖3 cyp19a 和cyp19b 的表達情況Fig.3 The expression of cyp19a and cyp19b

2.4 不同發(fā)育期的卵巢中雌二醇含量變化

見圖4。在II 期和III 期卵巢中, 雌二醇含量處于較低的水平。當許氏平鲉 雌魚卵巢發(fā)育至IV 期的時候,雌二醇含量極速升高, 達到峰值。此后出現(xiàn)回落, 在體節(jié)期再次上升, 回歸到峰值水平, IV 期和體節(jié)期時許氏平 鲉體內的雌二醇含量顯著高于其他時期。整體看來, 許氏平 鲉妊娠期體內的雌二醇的含量保持在較高的水平。大菱鲆在卵子發(fā)生過程中體內的雌二醇含量變化趨勢與許氏平 鲉基本一致, 從III 期發(fā)育到IV 期的時候, 雌二醇含量極速上升, 然后在V 期出現(xiàn)回落。

圖4 不同發(fā)育期的卵巢中雌二醇含量變化Fig.4 Changes of estradiol content in ovaries at different developmental stages

3 討論

許氏平 鲉雌魚在卵子發(fā)生過程中的組織學形態(tài)與卵生魚類相似(朱亮華等, 2018)。當卵巢發(fā)育至II期的時候, 卵巢內以2 時初級相卵母細胞為主。2 時相初級卵母細胞體積較小且形狀不規(guī)則, 呈多邊形,胞質呈強嗜堿性, 核質均勻且著色較淺。此時的卵母細胞沒有發(fā)育出清晰的濾泡層結構, 細胞外僅有一層濾泡細胞結構。當卵巢發(fā)育至III 期的時候, 卵巢內以3 時相卵母細胞為主。3 時相卵母細胞被生殖上皮包圍, 呈圓球形, 濾泡細胞發(fā)展成2 層。卵母細胞皮質部分出現(xiàn)體積大于皮層小泡的油球, 以后油球數(shù)目逐漸增多。當卵巢發(fā)育到IV 期的時候, 卵巢內充滿4 時相卵母細胞。4 時相卵母細胞較3 時相卵母細胞體積進一步增大, 卵黃顆粒數(shù)量迅速增多、體積迅速增大, 濾泡層被壓縮變窄。當卵巢發(fā)育至V 期時,卵母細胞已充分發(fā)育成熟, 細胞內充滿成熟卵黃顆粒,部分卵黃顆粒開始融合。

但是許氏平 鲉卵子發(fā)生過程與卵生魚類不同的地方在于, 當卵巢發(fā)育到III 期的時候, 濾泡層發(fā)育為2 層, 生殖上皮包繞住了3 時相卵母細胞, 形成了許多獨立的卵泡。雌魚和雄魚在這一時期交配, 交配后精子散落的分布在卵巢腔內。獨立的卵泡通過莖狀結構分別與基質相連, 使得每個卵泡與精子接觸的概率大致相同, 并且卵泡能夠從基質以及包繞在濾泡層上的血管中直接獲得營養(yǎng), 減少了卵子之間的競爭, 從而保證受精和營養(yǎng)吸收效率。

受精后, 我們在組織學上并沒有發(fā)現(xiàn)胚胎外的2細胞結構, 說明濾泡層在受精前或者受精過程中就已經破裂, 這與Bretschneider 等(1947)的研究結果一致。此后, 濾泡層迅速增殖并侵入周圍的結締組織,變得高度肥大, 廣泛折疊和高度血管化, 并在囊胚期迅速形成濾泡胎盤。該結構在形態(tài)上非常類似于哺乳動物絨膜尿囊胎盤的一部分(Groveet al, 1994;Laksanawimolet al, 2006; Kwanet al, 2015 )。

在許氏平 鲉卵子發(fā)生的過程中, 血漿中雌二醇的含量不斷增加, 這與史丹等(2011)的研究結果一致。并且我們發(fā)現(xiàn), 當卵巢發(fā)育到IV 期的時候, 許氏平 鲉體內的雌二醇含量顯著高于其他時期, 達到峰值。由于Shi 等(2011)將IV 期和V 期的雌二醇含量合并到一起, 所以并沒有非常突出的高于II 期和III期, 但在整個卵子發(fā)育期仍然呈現(xiàn)上升趨勢, 進一步印證了雌二醇具有促進卵黃蛋白原產生從而促進卵巢發(fā)育的作用。這一結果與一些卵生魚類, 如: 斜帶石斑魚(Epinephelus coioides) (趙會宏等, 2003)、赤點石斑魚(Epinephelus akaara) (劉付永忠, 2004)、雙棘黃姑魚(Nibea diacanthus) (沈卓坤等, 2007)等研究結果相同。在胚胎發(fā)育的過程中, 當胚胎發(fā)育至體節(jié)期的時候, 血漿中雌二醇的含量再次上升達到一個小高峰, 同時cyp19a、cyp19b的表達也高于囊胚期, 我們推測這可能說明雌二醇對母體維持妊娠具有一定的支撐作用。

雌激素必須與雌激素受體結合才能發(fā)揮作用,我們通過追蹤Era在許氏平 鲉卵巢上的定位發(fā)現(xiàn), 在III 期和IV 期卵巢上沒有檢測到Era的信號。當卵巢發(fā)育到V 期的時候, 在濾泡層和基質中都出現(xiàn)了強烈的陽性信號, 并且在囊胚期的時候信號依然非常明顯。硬骨魚類和哺乳類ERa在DNA 結合區(qū)和配體結合區(qū)高度保守, 這兩個功能域的可相似性分別達到90%和60%。在哺乳動物中,ERa主要在子宮、乳腺、卵巢以及輸卵管中表達(Couseet al, 1997), 因此我們推測許氏平 鲉的濾泡胎盤可能與哺乳動物的胎盤存在某些功能上的相似性。

cyp19a在雌性許氏平 鲉中僅在卵巢和腦中有表達, 且在卵巢中的表達量高于腦。這與Wen 等(2014)的研究結果基本相似, 他們認為cyp19a僅在許氏平鲉的卵巢中有表達, 這可能與所采用的樣品處于不同的發(fā)育時期或者實驗時所用的PCR 循環(huán)數(shù)不同有關。這與金魚(Carassius auratus) (Tchoudakovaet al,1998)、斑馬魚(Denio rerio) (Kishidaet al, 2001)在其他外周組織也有表達的研究結果也有所不同, 這些差異可能與不同魚類之間物種差異以及發(fā)育時期的不同有關。但無論在哪種魚類中,cyp19a在卵巢中的表達量都是最高的, 這也說明了cyp19a在維持卵巢發(fā)育方面具有重要的作用。cyp19b在卵巢、脾臟、腦和肝臟中都有表達, 其中腦的表達量最高, 卵巢、脾臟和肝臟中微弱表達, 這與楊艷平等(2012)的研究結果基本相似, 他們認為cyp19b在腦、卵巢、脾臟和頭腎中表達, 這可能與樣品處于不同的發(fā)育時期有關。我們的研究結果與三斑石斑魚(Epinephelus trimaculatus)(陳華譜等, 2012)的結果相同。在卵巢發(fā)育的不同時期, 在許氏平 鲉整個卵巢發(fā)育時期,cyp19a在III 期、IV 期、V 期、囊胚期和體節(jié)期均有表達, III 期、IV 期和體節(jié)期的表達要強于V 期和囊胚期, 孵化前期沒有表達。這與Wen 等(2014)等的結果一致, 在他們的研究結果中, 從7 月到9 月、11 月次年1 月以及3 月,cyp19a的表達量基本相同, 5 月時表達量有所下降。我們對于發(fā)育時期的劃分要更為清晰, 并且對妊娠時期的許氏平 鲉卵巢中cyp19a的表達量進行了補充。cyp19b在整個卵巢發(fā)育過程中只在III 期、IV 期和體節(jié)期有表達, 且體節(jié)期的表達強于IV 期, III 期的條帶極其微弱。在V 期、囊胚期和孵化前期沒有表達。這與楊艷平等(2012)和Kwon 等(2013)的研究結果基本一致, 楊艷平等(2012)只研究了卵子發(fā)生期和退化期, 在卵子發(fā)生期cyp19b只在III 期和IV 期表達; Kwon 等(2013)的研究結果顯示cyp19b在卵黃積累期和妊娠期都有表達, 這同樣與我們的實驗結果吻合, 只是我們對卵黃積累期和妊娠期進行了進一步的細化, 發(fā)現(xiàn)cyp19b在整個卵巢發(fā)育過程中只在III 期、IV 期和體節(jié)期有表達。我們認為cyp19b在體節(jié)期的高表達或許是作為雌二醇來源的一個補充,cyp19a和cyp19b在體節(jié)期的高表達共同導致了雌二醇在處于體節(jié)期的許氏平 鲉體內有較高含量這一結果, 由此我們推測cyp19b對許氏平卵巢的發(fā)育同樣發(fā)揮著重要的作用。

4 結論

本文分析了與雌二醇合成及作用密切相關的cyp19a和Era在許氏平 鲉卵巢上的定位, 芳香化酶cyp19a、cyp19bmRNA 在不同組織中和不同卵巢發(fā)育時期的表達, 以及不同發(fā)育期的卵巢中雌二醇含量變化。首先, 在V 期卵巢的濾泡層、基質和囊胚期的濾泡胎盤上都檢測到了強烈的Era的信號。其次,cyp19a和cyp19b在卵巢中均有表達且在不同的卵巢發(fā)育期表達量不同。在卵黃積累的過程中,cyp19a和cyp19b在IV 期的表達量最高, 在妊娠過程中則是體節(jié)期表達量最高。除此之外, 在卵巢發(fā)育的過程中,許氏平 鲉體內雌二醇含量的峰值分別出現(xiàn)在IV 期和體節(jié)期。這些結果說明雌二醇在胎生魚類卵子發(fā)生及妊娠過程中均起到非常重要的作用。本文從雌激素的角度出發(fā), 結合許氏平 鲉卵巢自身的組織學結構特點, 就許氏平 鲉卵巢發(fā)育及其胎生的生殖方式提供了新的解讀, 為許氏平 鲉胎生這一特殊的生殖方式的研究提供了新的思路。