內共生菌Sulcia muelleri與Sodalis sp.在大青葉蟬中的分布

練啟仙, 劉健鋒, 楊茂發*, 羅 亭, 周小蕓, 吳 廣

(1.貴州大學， 貴州 貴陽 550025； 2.興義民族師范學院， 貴州 興義 562400)

0 引言

【研究意義】大青葉蟬Cicadellaviridis分布范圍廣，國外主要在日本、東南亞、印度以及歐洲等國家發生危害，我國北自黑龍江，南至海南，東自江蘇、山東，西至西藏、新疆均有分布[1]。該害蟲可危害禾谷類農作物、果蔬等160余種植物[1]。大青葉蟬主要是以成蟲和若蟲危害葉片，刺吸汁液，造成褪色、畸形、卷縮，甚至全葉枯死[2]，同時大青葉蟬還可傳播植物病原菌[2-4]，是危害果樹及林木的大敵。經研究，昆蟲體內具有內共生菌，同時內共生菌可用于害蟲防治以及降低昆蟲傳播病毒的能力[5]，因此探明大青葉蟬體內共生菌的分布，對利用調控體內共生菌以控制該害蟲、減少蟲傳植物病毒病、化學農藥對環境的污染和天敵等有益生物的傷害具有重要意義。【前人研究進展】內共生菌廣泛分布于昆蟲中，內共生菌能影響宿主所需的氨基酸等營養物質[6-8]，使雄蟲雌性化[9-10]，影響宿主的生長與繁殖[11]。但共生菌在不同種類昆蟲體內的分布部位存在差異。如油橄欖實蠅幼蟲中，共生菌存在于中腸胃盲囊中[12]；內共生菌存在于菌胞體內的昆蟲有藥材甲和煙草甲[13]；NODA等[14]在飛虱的脂肪體中發現了類酵母菌；沃爾巴克氏體(Wolbachia)主要分布于昆蟲生殖器官中[15]。【研究切入點】目前，已在大青葉蟬中檢測到了內共生菌Sulciamuelleri[16-18]、Sodalissp.[17-18]和立克次氏體(Rickettsiasp.)[19]，但關于Sulciamuelleri、Sodalissp.在大青葉蟬中的分布及對其生長發育的影響尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】通過用特異引物和PCR技術研究大青葉蟬體內共生菌的分布及其拷貝數，為利用內共生菌對大青葉蟬進行生物防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源 大青葉蟬發生期，于貴陽市花溪區雜草地隨機采集大青葉蟬成蟲(雌、雄)，在室內利用水稻苗飼養產卵，卵孵化為若蟲，成長為成蟲，期間收集卵、1～5齡若蟲和雌雄成蟲供試驗用。

1.1.2 引物與探針 用Primer 5設計Sulciamuelleri和Sodalissp.的16S rDNA序列的特異引物和TaqMan探針，由上海生物生工公司合成。

引物序列：SulendCV-F，5′-GTAGCGGTGAAATGCGTAGAT-3′；SulendCV-R，5′-TTCAACCTTGCGGTCGTACT-3′；SodendCV-F，5′-AAAGGAGACTGCCGGTGATAA-3′；SodendCV-R，5′-GGACTACGACGCACTTTATGAGA-3′[20-21]。

探針序列：SulendCV-P，5′-CCAATAGCGAAAGCAAGTTACTAAGCCT-3′；SodendCV-P，5′-CATGATGACTTGACGTCATCCCTACCT-3′[20-21]。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取及PCR擴增 將保存于-20℃的不同蟲態的大青葉蟬清洗干凈后放在1.5 mL的無菌離心管中磨碎，然后根據QIAGEN試劑盒說明書的步驟提取樣品DNA，并用特異引物進行PCR擴增。反應體系總體積為25 μL，其中包括含Mg2+的10×buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，引物(10 μmol/L)各0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 18 μL。PCR的反應程序：預變性95℃ 3 min，變性94℃ 30 s，退火57℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，循環35個，最后延伸72℃ 10 min。完成擴增后進行凝膠電泳檢測。

1.2.2 標準質粒的提取與測序 PCR純化產物與pMD?18-T載體相連接后將其轉到感受態細胞中(Trans1-T2)，涂板后培養過夜(37℃)，而后選取單個菌落置于含有濃度為50 μg/mL的Amp LB培養基中(5 μL)，振蕩培養10 h(37℃)，最后利用Easy Pure? Plasmid MiniPrep Kit對陽性克隆子進行質粒的提取，質粒送上海生物生工公司測序。

1.2.3 絕對定量PCR 利用絕對定量PCR(TaqMan探針法)檢測其樣品DNA，反應體系總體積為20 μL，其中10 μL TransStart?Probe qPCR Super Mix，引物(10 μmol/L)各0.4 μL，熒光探針0.4 μL， ddH2O6.8 μL， DNA模板2 μL。反應程序：94℃預變性3 min，94℃變性5 s，57℃退火15 s，72℃延伸30 s，40個循環。添加樣品后，置于Light Cycler480 Software Setup (Roche)中反應。

1.2.4 大青葉蟬不同發育歷期的內共生菌感染率檢測 在室內用水稻苗飼養大青葉蟬，獲得大青葉蟬的卵、若蟲、雌雄成蟲，清洗干凈后按照QIAGEN試劑盒說明書提取其DNA，然后用特異引物檢測卵、1～5齡若蟲、雌雄成蟲的內共生菌感染率，分別檢測10頭，檢測2代。

1.2.5 大青葉蟬不同發育歷期的內共生菌拷貝數的檢測 按照QIAGEN試劑盒說明書提取大青葉蟬卵、1～5齡若蟲、雌雄成蟲各發育歷期的DNA，然后用絕對定量PCR對其內共生菌的拷貝數進行檢測。

1.2.6 大青葉蟬組織器官的內共生菌拷貝數的檢測 利用乙酸乙酯立即殺死大青葉蟬成蟲后用酒精(75%)和無菌水清洗干凈，然后置于無菌且有0.9%氯化鈉溶液的凹玻片上，體視鏡下解剖出菌胞體、卵巢、精巢、腸、唾液腺，每種組織器官取3個樣品，每個樣品來自解剖3頭大青葉蟬，用PBS清洗后提取DNA。然后檢測樣品中S.muelleri和Sodalissp.的16S rDNA的拷貝數。

2 結果與分析

2.1 大青葉蟬不同發育歷期的內共生菌感染率

經檢測，在2代大青葉蟬的卵、1～5齡若蟲和成蟲各發育期均檢測到S.muelleri和Sodalissp.內共生菌，且感染率為100%。

2.2 大青葉蟬不同發育歷期的內共生菌拷貝數

如圖1所示，S.muelleri內共生菌拷貝數在大青葉蟬5齡若蟲中最高，而Sodalissp.內共生菌拷貝數在雌成蟲中最高，S.muelleri和Sodalissp的拷貝數在卵中最少。從卵到5齡若蟲，S.muelleri和Sodalissp.的拷貝數除在3齡若蟲階段有所下降外，其余階段隨著發育歷期的增加而增高。

圖1 大青葉蟬不同發育歷期S. muelleri和Sodalis sp. 的拷貝數

2.3 大青葉蟬不同組織器官的內共生菌拷貝數

由表1可見，在大青葉蟬的卵巢、精巢、中腸、唾液腺、菌胞體中均檢測出S.muelleri和Sodalissp.，然而在不同的組織器官中其數量又存在差異。在菌胞體中S.muelleri和Sodalissp.的拷貝數均較高，但在雄蟲的腸及雌雄成蟲的唾液腺當中卻較少。

表1 大青葉蟬不同組織器官的內共生菌拷貝數

3 討論

大部分的昆蟲體內含有內共生菌，且存在于昆蟲的各個發育歷期和組織器官。WANGKEEREE等[22]在檢測不同生長階段的網脈融莖葉蟬和其各組織器官，其內共生菌BAMH存在于各發育期及其組織器官當中；廖珊等[23]試驗證實，在灰飛虱的生殖器官、消化道等中具有沃爾巴克氏體(Wolbachia)；陳吉強等[24]在煙粉虱MEAM1隱種的卵、若蟲和成蟲中檢測到CandidatusHamiltonella defensa、CandidatusProtiera aleyrodidarum和立克次氏體(Ricketsiasp.)3種內共生菌，同時立克次氏體還存在于菌胞體以及一些器官中。NODA等[11]發現，內共生菌S.muelleri存在于黑尾葉蟬的菌胞及卵巢當中。該研究結果與前人研究一致，大青葉蟬的卵、若蟲、雌雄成蟲均感染了S.muelleri和Sodalissp，此外在菌胞體、卵巢、精巢、中腸、唾液腺中均檢測到2種內共生菌，說明2種內共生菌能通過大青葉蟬的雌蟲完成垂直傳播。

不同昆蟲體內的共生菌，其作用有所不同，如蠐螬后腸中細菌群落，能為蠐螬提供必需的甾醇類物質；種蠅(Hylemya)幼蟲的消化道內的細菌能產生維生素B及其他重要的營養物質，使幼蟲發育加快；蠟螟體內共生菌能促進蠟的消化；白蟻消化道中的細菌能固定大氣中的氮，并為昆蟲的組織吸收利用[13]。甘蔗長蝽體內的伯克霍爾德氏菌具有降解農藥的作用[25]；立克次氏體可以提高煙粉虱各齡期的存活率、延長其成蟲壽命[26]；Cardinium可增加煙粉虱的雌性比例[27]。大青葉蟬體內的共生菌S.muelleri可合成宿主需要的氨基酸[28]，然而Sodalissp.對宿主的作用還需進一步研究。

大青葉蟬的不同發育歷期及不同器官和組織所攜帶的S.muelleri、Sodalissp.內共生菌的拷貝數不同，從卵到2齡其內共生菌S.muelleri、Sodalissp.的拷貝數呈上升趨勢，然而在3齡時降低，從4齡開始又增加，2種內共生菌在菌胞體中的含量最多，其次是雌雄生殖器官，說明S.muelleri、Sodalissp.內共生菌在大青葉蟬體內有一定的動態變化規律。為進一步研究內共生菌與寄主之間的相互關系和利用內共生菌對大青葉蟬進行生物防治提供參考。

4 結論

大青葉蟬體內和不同組織及器官(菌胞體、卵巢、精巢、中腸、唾液腺)中均檢測到S.muelleri和Sodalissp.內共生菌，S.muelleri內共生菌在5齡若蟲中拷貝數最高，Sodalissp.內共生菌在雌蟲中最多，2種內共生菌在卵中均最少；2種內共生菌均在菌胞體中的拷貝數最高，在雄蟲的腸、雌雄唾液腺當中卻很少。