攀西礦區典型重金屬污染土壤化學-微生物聯合修復技術探索

鄧敏,程蓉,舒榮波,徐璐,李超,代力

（中國地質科學院礦產綜合利用研究所, 礦山生態調查修復室, 四川 成都 610041）

攀西地區是我國重要的成礦帶，礦產資源豐富，其區域土壤背景值偏高[1-2]。持續多年的高強度礦產開采導致部分地區出現較為嚴重的土壤重金屬污染問題[3-4]。多項調查研究表明，攀西地區部分礦產集中開采區周邊土壤中鉛、鋅、鎘、鉻等重要環境健康指標出現污染情況，對該區域生態環境質量、糧食安全、人體健康造成了潛在威脅[5-6]。針對土壤重金屬污染問題，目前一般采用物理修復、化學修復與生物修復技術。物理修復工程浩大，成本較高，難以大規模應用[7]。化學修復是一種比較成熟的土壤重金屬污染修復技術，其中有機絡合成本低、見效快，目前主要用于農田土壤重金屬絡合鈍化，但也存在二次污染的問題[8-9]。生物修復成本低、綠色無污染，是土壤重金屬修復的重點發展方向，并且以微生物為核心的多種修復方法聯合使用將受到越來越多的重視[10]。

微生物穩定，同時輔以化學絡合是目前重金屬鈍化的研究熱點[11-12]。適宜的化學絡合劑不僅可絡合穩定重金屬，還可以供給微生物生長，在穩定土壤重金屬的同時，還解決了化學修復的二次污染問題，具有廣闊的應用前景[13]。目前主流的絡合劑有檸檬酸、草酸、丙酸等，主要用于重金屬鈍化材料以及強化植物萃取劑的制備[9]。可用于穩定化的微生物也有很多，其中又以硫酸鹽還原菌（(Sulpate-Reducing Bacteria, SRB)為代表，SRB是一類能通過異化作用進行硫酸鹽還原的細菌，其生存、適應能力較強，目前SRB已廣泛應用于重金屬廢水（電鍍廢水、礦山酸性廢水）以及重金屬沉積物處理[14-15]，但迄今為止，將SRB應用于土壤重金屬修復的研究還鮮有報道。

因此本研究以SRB為修復微生物，以有機酸類為絡合劑，開展了SRB篩選及生長特征考察實驗、化學絡合實驗和化學-微生物聯合修復實驗，綜合探索了化學絡合-微生物穩定聯合修復技術體系應用的可能性，希望開發出具有成本低、效率高、綠色安全等優點的化學-微生物聯合修復技術，為解決攀西地區土壤重金屬污染問題提供有參考價值的基礎研究。

1 實 驗

1.1 實驗材料

1.1.1 供試土壤

供試土壤采自于攀枝花某地，剔除雜質、風干，磨細并過尼龍篩，備用。土壤理化性質見表1。

表1 土壤基本理化性質Table 1 Basic physical and chemical properties of soil

1.1.2 實驗試劑

本次研究所用的試劑均為分析純（AR），包括無水硫酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化銨、硫酸亞鐵銨（六水）、氯化鈉、丙酸鈉、酵母膏、丙三醇、丁二酸鈉、乙酸鈉、乳酸鈉、葡萄糖、正丁醇、草酸、檸檬酸、蘋果酸、丙酸、丁二酸、乙酸、氯化鎘、氯化鉛等。

1.1.3 供試SRB純菌菌種

本試驗過程中采用的純種細菌為脫硫弧菌脫硫亞種（Desulfovibriodesulfuricans subsp.desulfuricans）由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供，購買編號為1.3469。

1.2 實驗方法

1.2.1 微生物篩選參照杜剛[16]研究，SRB富集培養基配方見表2。

表2 SRB的富集培養基配方(1 L)Table 2 Enrichment medium formulation of SRB

1.2.2 硫酸鹽還原菌對鎘、鉛鈍化還原效果分析

配置SRB液體培養基加入CdCl2/PbCl2，用NaOH調pH值為7.0，分別將純菌和混合菌接種至液體培養基，然后置于厭氧培養箱中培養，觀察混合菌對Cd2+、Pb2+的鈍化還原情況，并檢測Cd2+、Pb2+的濃度，分析其去除率。

去除率=(C初-C末)/C初× 100%

式中：C初為溶液中Cd2+/Pb2+初試濃度，mg/L。

C末為鈍化還原后溶液中Cd2+/Pb2+濃度，mg/L。

1.2.3 SRB對化學絡合劑的利用效果分析

參照毛在砂[17]的研究，在保證總含碳數一致的標準下，選取12種碳源：乳酸鈉、檸檬酸三鈉、乙酸鈉、丙酸鈉、丁二酸鈉、草酸鈉、酒石酸鈉、丙三醇、正丁醇、葡萄糖、檸檬酸、蘋果酸。通過測定FeS生成量來分析SRB對不同底物的利用狀況[18]。本次實驗培養基培養環境為pH=7.0、T=30 ℃，除碳源外，其他營養物質參照表2配置。

1.2.4 化學絡合劑對土壤重金屬的絡合效果分析

選取上述微生物碳源，分別以液固比1:20、1:100、1:200、1:300(其中“液”指化學絡合劑，單位mL；“固”指土壤，單位：g，下同)加入土壤[19]。待土壤穩定后，分別檢測土壤重金屬鎘、鉛形態特征變化，重金屬形態采用Tessier[20]五步萃取法測定，對照為未作處理的土壤，記為CK。

1.2.5 化學-微生物聯合修復對土壤重金屬穩定化效果分析

先將絡合劑以用1:300和1:200的液固比[19]施入土壤中，再將SRB接入土壤，然后置于厭氧培養箱中培養，待土壤穩定后，分析鉛、鎘形態變化以及土壤肥效變化，肥效參數測定參照《土壤農化分析》[21]進行，對照樣與1.2.4使用的保持一致，同樣記為CK。

2 實驗結果

2.1 硫酸鹽還原菌篩選

在四川某一排污井取污泥樣，進行選擇性培養，獲得一株混合型SRB。該混合菌生長過程中的代謝產物硫化氫(H2S)與培養基中的亞鐵離子（Fe2+）結合生成硫化亞鐵沉淀(FeS)，連續10次以上10%接種液體培養，所得菌種培養液在培養3 d后，使用血球計數板計數，菌液濃度均可達到1.827×1010個/mL，菌種生長穩定。

2.2 硫酸鹽還原菌混合菌基本生長特征

圖1為該混合菌的基本生長特征。

圖1 混合菌生長特征曲線Fig. 1 Growth characteristic curve of mixed bacteria

從圖1中可以看出，該混合菌的生長遲緩期較短(在8 h以內)，此后進入對數生長期，在48 h后進入穩定期，最大OD600值為0.777。培養過程中pH值變化呈現先減少再逐步緩慢增加的趨勢。

2.3 硫酸鹽還原菌純菌基本生長特征

為對比研究該混合菌的基本生長特征，購買純種厭氧細菌進行實驗。

從圖2看出，該純菌的生長遲緩期較短，在8 h以內，此后進入對數生長期，在60 h后進入穩定期，最大OD600值為0.344，由此可見，該株純菌的總體生長代謝速率低于混合菌。培養過程中pH值變化同樣呈現先減小再逐步緩慢增加的趨勢。

圖2 純菌生長特征曲線Fig. 2 Growth characteristic curve of pure bacteria

2.4 硫酸鹽還原菌混合菌對鎘、鉛去除效果

混合菌對Cd2+的鈍化還原沉淀結果表明，添加菌體后，出現絮狀顆粒物或黑色固體，初步猜測為SRB的代謝產物H2S與Cd2+、Pb2+沉淀之后形成的硫化物[22]。幾乎所有的反應器覆封口膜破裂，并伴有臭雞蛋味，初步推算為生成硫化氫氣體，且接種量越大的氣味越重。對其中的Cd2+、Pb2+的濃度進行分析，見表3。

表3 SRB混合菌對Cd2+、Pb2+去除效果Table 3 Removal efficiency of Cd2+ and Pb2+ by SRB mixed bacteria

從表3看出，SRB混合菌對初始濃度為15mg/L和52 mg/L的含Cd2+、Pb2+溶液均有一定的效果，但不同的Cd2+、Pb2+濃度沉淀效果存在差異：在15和52 mg/L條件下，SRB鈍化還原168 h后，對鎘的去除率分別為94.8%和15.4%，對鉛的去除率分別為93.9%和42.3%，表明SRB混合菌對低濃度(15mg/L) Cd2+、Pb2+去除效果較好，但對高濃度(50mg/L) Cd2+、Pb2+去除效果不理想，這可能是因為在高濃度Cd2+、Pb2+條件下，SRB易受到毒害作用，導致鈍化還原效率降低。

2.5 硫酸鹽還原菌純菌對鎘、鉛去除效果

為了驗證SRB對鎘、鉛的鈍化還原效果，進一步選用純菌考察SRB對鎘、鉛的還原效果，實驗結果見表4。

表4 SRB純菌對Cd2+去除效果Table 4 Removal efficiency of Cd2+ by SRB pure bacteria

從表4可發現，隨反應時間增加，溶液中的Cd2+、Pb2+逐漸減少，對各濃度Cd2+、Pb2+的還原效果均在187 h處達到最大：187 h時，對10.36 mg/L的Cd2+去除效率達91.6%，52.80 mg/L的Cd2+去除率達83.3%；對9.87 mg/L的Pb2+除效率達90.6%，52.53 mg/L的Pb2+去除率達40.9%，表明SRB對Cd2+、Pb2+確能產生一定的鈍化還原效果。

從表4可以發現，SRB純菌和混合菌對低濃度Cd2+、Pb2+鈍化還原效果相差不大，Cd2+、Pb2+兩種重金屬離子在SRB作用下的去除率也較為一致，結合SRB純菌和混合菌的生長規律（混合菌的總體生長代謝速率高于純菌）以及攀西地區污染特征，選定SRB混合菌進行下一步研究。

2.6 硫酸鹽還原菌對化學修復劑的利用狀況

本次研究擬采用微生物穩定化土壤重金屬，同時結合低分子有機酸進一步絡合穩定土壤重金屬，因此考察了SRB對化學修復劑的利用狀況，預期獲得既可絡合重金屬土壤又可作為細菌生產底物的化學絡合劑。因此嘗試不同的有機物作為絡合修復試劑，定量考察FeS的生成量來反映SRB對不同底物的利用狀況。不同碳源和不同FeSO4濃度下生成的粗FeS的濃度見表5。

表5 不同碳源下生成的粗FeS的濃度Table 5 Concentration of crude FeS generated under different carbon sources

從表5中可發現，在相同摩爾數不同碳源條件下，丁二酸鈉、乳酸鈉、正丁醇、檸檬酸、蘋果酸、丙酸6種碳源表現出了較好的FeS生成能力，Δ FeS介于5.91 ～ 29.75 g/L，其中檸檬酸和蘋果酸表現較優，其Δ FeS分別為29.75、24.91 g/L，其余碳源條件下，SRB生成FeS的能力較差，均低于4.80 g/L。說明SRB對檸檬酸和蘋果酸利用率較高，對丁二酸鈉、乳酸鈉、正丁醇和丙酸利用效果一般，對丙三醇、乙酸鈉、葡萄糖、草酸、丁二酸和乙酸利用效果較差。

從FeS的生成量和實際觀察來看，SRB對檸檬酸和蘋果酸均表現出了較為良好的利用效果，因此選定檸檬酸和蘋果酸作為本研究的化學絡合劑，并進一步考察其對土壤的絡合效果。

2.7 化學絡合劑對重金屬形態的影響

圖4 檸檬酸/蘋果酸對土壤中鉛形態變化影響Fig. 4 Effects of citric/malic acid on the Pb speciation in soil

化學絡合劑對重金屬形態的影響見圖3、4。從圖3、4可以看出，當加入的檸檬酸和蘋果酸較少時（液固比為1:300），能對土壤中重金屬鎘有一定的穩定作用，與對照相比，鎘交換態占比最大下降了25.0%，對鉛的影響不明顯。但隨著檸檬酸和蘋果酸加入量的增加（液固比大于1:200），土壤pH逐漸降低，鎘、鉛可交換態增加，與對照相比，鎘交換態占比較大增加了107.4%，鉛可交換態最大增加了726.9%，重金屬被活化。表明低劑量的檸檬酸和蘋果酸能對土壤重金屬起到一定的絡合穩定作用，而高劑量的檸檬酸和蘋果酸會對土壤起到酸溶作用，導致重金屬被解析。

圖3 檸檬酸/蘋果酸對土樣土壤中鎘形態變化影響Fig. 3 Effects of citric/malic acid on the Cd speciation in soil

2.8 化學-微生物聯合修復對土壤重金屬的鈍化效果

化學-微生物聯合修復對土壤重金屬的穩定化效果見圖5、6。

圖5 化學-微生物聯合修復對土壤中鎘形態變化影響Fig. 5 Effects of chemical-microbial combined remediation on Cd speciation in soil

從圖5可以看出，化學-微生物聯合修復在一定程度上能降低土壤中鎘的活性，特別是當以1:300的液固比加入檸檬酸、蘋果酸并接入SRB后，鎘可交換態有一定程度的降低，有機結合態有一定程度的提高：SRB作修復微生物，檸檬酸或蘋果酸作化學絡合劑時，鎘可交換態占比分別降低了60.7%、38.1%，有機結合態分別提升了23.2%、16.1%；從圖6可以看出，在土樣中加入檸檬酸或蘋果酸并接入SRB后，鉛的鐵錳結合態占比有一定的降低，殘渣態有一定程度的提高，鉛的鐵錳結合態占比最大降低了25.9%，有機結合態較高占比最大提高了21.8%。實驗表明化學-微生物聯合修復能使鎘、鉛朝著更為穩定的形態轉變。

圖6 化學-微生物聯合修復對土壤中鉛形態變化影響Fig. 6 Effects of chemical-microbial combined remediation on Pb speciation in soil

此外，從化學絡合修復與化學-微生物聯合修復實驗效果來看，其聯合修復效果優于單絡合修復，如：與對照相比，絡合修復鎘交換態占比最大下降了25.0%，而化學-微生物聯合修復鎘交換態最大降低達到60.7%，對重金屬鉛（鐵錳結合態）也有類似的結果。

2.9 化學-微生物聯合修復對土壤肥效的影響

本次研究同時考察了化學-微生物聯合修復對土壤肥效的影響，實驗結果見表6。

表6 化學-微生物聯合修復對土樣肥效的影響Table 6 Effects of chemical microbial remediation on soil fertility

從表6中可以看出，僅加入檸檬酸和蘋果酸對土壤肥效影響有限：CEC、全氮、堿解氮、速效鉀、有效磷含量變化不明顯，僅對有機質含量有略微的提升。但在加入有機酸（檸檬酸/蘋果酸）和微生物菌液后，土壤肥效有一定程度提高，其中有機質、CEC、全氮、堿解氮、速效鉀、有效磷最大分別提高了48.5%、7.5%、18.5%、27.6%、16.1%、65.3%、74.3%。實驗表明，僅加入有機酸，對土壤肥效影響不大；加入有機酸和微生物菌液，能在一定程度上提升土壤肥效。

3 分析討論

SRB(Sulpate-Reducing Bacteria, SRB)是一類能通過異化作用進行硫酸鹽還原的細菌，在厭氧/低氧條件時，SRB能通過異化硫酸鹽還原作用將SO42-還原為H2S，重金屬離子可以和H2S反應生成金屬硫化物沉淀，從而將重金屬離子沉淀下來，本文中2.4、2.5結果與此擬合，說明SRB確能穩定化重金屬。

在土壤中，SRB穩定化重金屬一般認為是通過以下三個途徑[23]：①SRB通過異化作用將SO42-還原為S2-，進而與土壤中重金屬M形成MS，從而穩定化土壤重金屬；②硫酸鹽還原過程中生成的S2-會使pH升高，降低了土壤酸性，有利于重金屬離子生成氫氧化物沉淀；③SRB在代謝過程中分解有機物會產生CO2，重金屬離子也可與CO32-反應生成碳酸鹽而降低其活性。在本研究中SRB通過這三種途徑將土壤中較為活躍的重金屬形態轉變為更為穩定的重金屬硫化物，在一定程度上降低了重金屬的遷移性和植物的可利用性。

檸檬酸和蘋果酸等低分子機酸能提供配位基團與重金屬離子發生酸解絡合反應，調節和改變重金屬在土壤中的物理化學性質，使其產生沉淀、吸附、離子交換、腐殖化和氧化還原等一系列反應，這種外源物質與土壤中重金屬離子結合后，能夠改變其在土壤中的遷移性[24-25]。此外，部分絡合劑在直接作用于重金屬的基礎上，還可以作為SRB的有機碳源，促進還原態硫物質的形成，進一步穩定化土壤重金屬，從而綜合形成化學絡合-微生物穩定化處理重金屬的協同機制。此外，化學絡合-微生物穩定化處理過程中，在土壤中也會添加一定量的外源營養元素，這些營養物質在重金屬穩定化處理的過程中對土壤肥效也能起到一定的提升作用。

4 結 論

（1）本次篩選的SRB混合菌生長遲緩期較短(在8 h以內)，此后進入對數生長期，在48 h后進入穩定期，而純菌在60 h后進入穩定期，純菌的總體生長代謝速率低于混合菌。

（2）SRB混合菌和純菌對鎘、鉛確有良好的鈍化還原效果，在低濃度Cd2+、Pb2+（≤15 mg/L）條件下，去除率較大，可達94.8%、93.9%。

（3）低劑量的檸檬酸和蘋果酸能與土壤重金屬產生絡合作用，能在一定程度上降低重金屬活性，但隨著有機酸投加量的增加，易使其朝著更易被植物吸收的可交換態增加。

（4）化學-微生物聯合修復對土壤中重金屬鎘、鉛能起到一定的鈍化效果，鎘交換態占比最大降低60.7%、鉛鐵錳結合態最大降低了25.9%，同時有助于土壤肥效的提高。