含硅羥基磷灰石調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極性促進成骨分化機制研究

王志英，楊秋霞，田新利，林雪霞

硅是人體重要的微量元素，參與骨的代謝［1］，而羥基磷灰石（HA）是骨的主要無機成分。含硅羥基磷灰石（si-HA）具有良好的骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性，是一種性能優(yōu)良的無機骨再生修復(fù)材料［2］，多年來受到生物材料學(xué)界的普遍關(guān)注。但是，si-HA刺激成骨的確切機制尚未明確。既往研究多采用si-HA直接刺激成骨細(xì)胞，觀察其成骨分化，實現(xiàn)骨再生修復(fù)［3］。然而，體內(nèi)成骨過程是在由骨骼系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等多個系統(tǒng)細(xì)胞協(xié)同營造的局部微環(huán)境中完成的，以往研究往往忽視了炎癥反應(yīng)在材料介導(dǎo)成骨過程中所起的重要作用。隨著對宿主與生物材料相互作用研究的深入，學(xué)者們逐漸意識到生物材料植入體內(nèi)，并非只與成骨細(xì)胞接觸，首先與材料接觸的是免疫細(xì)胞［4］，免疫細(xì)胞是骨再生微環(huán)境的中心調(diào)控者［5］。在所有免疫細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞是啟動和維持炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞［6］。因此，本研究將巨噬細(xì)胞作為研究免疫調(diào)節(jié)的模型細(xì)胞。另據(jù)文獻報道，巨噬細(xì)胞具有極大的功能可塑性［7］。一般認(rèn)為其存在2種極化狀態(tài)，即M1型（炎癥型）和M2型（修復(fù)型）［8］。M1型巨噬細(xì)胞啟動炎癥反應(yīng)，分泌大量的促炎因子；M2型巨噬細(xì)胞參與組織的后期修復(fù)［9-11］。在成骨生物材料的作用下，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生何種極化狀態(tài)，在其產(chǎn)生的免疫微環(huán)境中，前成骨細(xì)胞會產(chǎn)生何種成骨能力的改變，鮮有報道。本研究采用小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7，RAW）和小鼠前成骨細(xì)胞（MC3T3-E1，3T3）通過體外實驗探索該機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞、試劑與儀器 3T3和RAW均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，高糖DMEM培養(yǎng)基、胰酶、雙抗、胎牛血清（Gibco，USA），CCK-8（biosharp生物科技公司），BCA試劑盒（Sigma公司，美國），堿性磷酸酶（ALP）活性檢測試劑盒（日本W(wǎng)AKO公司），Trizol Reagent（Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo公司），熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）試劑盒（Thermo Scientific公司）。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本SANYO，MCO-15AC），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS-CX41），低溫高速離心機（德國Sartorius-3k30），超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司，BCM-1000），多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek公司-ELx808），超微量紫外分光光度計（美國NanoDrop公司，NanoDrop2000）。

1.2 HA和si-HA納米粒子的制備 利用熱化學(xué)沉淀法制備HA和si-HA納米粒子。硝酸鈣［Ca（NO3）2·4H2O］為鈣源，磷酸氫二銨［（NH4）2HPO4］為磷源，醋酸硅［Si（CH3COO）4］在反應(yīng)過程中水解提供硅源。據(jù)文獻報道［3］和本實驗室前期研究［12］，當(dāng)摻硅量為0.8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時，si-HA具有最高的生物成骨活性，因此本研究采用此硅含量的si-HA。合成步驟：稱取Ca（NO3）2·4H2O 7.04 g和（NH4）2HPO43.094 g，分別溶于80 mL三蒸水中；將Ca（NO3）2·4H2O溶液倒入三口瓶，稱取Si（CH3COO）4粉末0.248 g（HA合成時不再加入）加入三口瓶中；調(diào)節(jié)溫度65℃，攪拌加熱1 h，直至Si（CH3COO）4溶解；將溫度設(shè)定為90℃，控制（NH4）2HPO4溶液緩慢均勻滴入三口瓶中，過程中不斷加入濃氨水溶液，使pH值穩(wěn)定在11；反應(yīng)1 h后，制備樣品靜置過夜。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 3T3和RAW細(xì)胞均采用高糖DMEM培養(yǎng)基，置于恒溫37℃、5%CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達80%~90%時，3T3細(xì)胞采用胰酶消化，1 000 r/min離心6 min，收集細(xì)胞后傳代。由于RAW細(xì)胞貼壁較牢，加入PBS，用細(xì)胞刮輕輕刮下，離心去除PBS，按1∶3比例進行傳代。取對數(shù)生長期的3T3和RAW細(xì)胞用于后續(xù)實驗。（1）RAW細(xì)胞分組。實驗設(shè)Control組、HA組和si-HA組。Control組RAW細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，不加入材料；HA組和si-HA組RAW細(xì)胞在DMEM完全培養(yǎng)基中分別加入10 mg/L的HA和si-HA納米粒子材料懸液進行培養(yǎng)。（2）3T3細(xì)胞分組。將完全培養(yǎng)基、HA和si-HA納米粒子刺激RAW細(xì)胞3 d后獲得的上清液，以1∶2的比例與完全培養(yǎng)基混合，稱為條件培養(yǎng)基（RAW條件培養(yǎng)基、HA+RAW條件培養(yǎng)基和si-HA+RAW條件培養(yǎng)基）。將3T3細(xì)胞分別采用3種條件培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，分為RAW組、HA＋RAW組和si-HA＋RAW組；另設(shè)空白對照組，采用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.4 qPCR檢測巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài) RAW細(xì)胞在完全培養(yǎng)基、10 mg/L HA與10 mg/L si-HA納米粒子材料懸液中分別培養(yǎng)3 d（Control組、HA組和si-HA組），采用qPCR檢測RAW細(xì)胞M1極化標(biāo)志物誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、M2極化標(biāo)志物Arginase基因及各種促炎、抗炎因子腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-10和IL-1ra的mRNA表達。細(xì)胞總RNA提取、cDNA合成、qPCR反應(yīng)均按照相應(yīng)試劑盒說明書進行。qPCR反應(yīng)總體系10μL，包括5μL qPCR mix SYBR green，3.4μL Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix和濃度為10μmol/L的上、下游引物各0.4μL，10倍稀釋的cDNA 0.8μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃10 min；95℃15 s，60℃35 s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法計算細(xì)胞中基因相對表達量。實驗重復(fù)3次。引物序列見表1。

Tab.1 Amplification of gene primers by qPCR表1 qPCR擴增基因引物序列

1.5 條件培養(yǎng)基對3T3細(xì)胞增殖及成骨分化的影響

1.5.1 3T3細(xì)胞在條件培養(yǎng)基中的增殖情況 取對數(shù)生長期3T3細(xì)胞，按密度3×103個/孔接種于96孔板中，置于37℃、5%CO2、濕度100%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后分別更換完全培養(yǎng)基（空白對照組）和不同的條件培養(yǎng)基（RAW條件培養(yǎng)基、HA+RAW條件培養(yǎng)基和si-HA+RAW條件培養(yǎng)基），每組均設(shè)置5個平行復(fù)孔，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1、3和7 d。每孔加入含10%CCK-8的培養(yǎng)液100μL，培養(yǎng)箱中避光孵育1 h；酶標(biāo)儀檢測在450 nm處各孔細(xì)胞光密度（OD）值，分析細(xì)胞增殖情況。實驗重復(fù)3次。

1.5.2 3T3細(xì)胞在條件培養(yǎng)基中的成骨分化能力（1）3T3細(xì)胞ALP活性定量分析。將3T3細(xì)胞按密度1×104個/孔接種于24孔板，貼壁培養(yǎng)24 h后，分別更換完全培養(yǎng)基（空白對照組）和不同條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)基每2~3 d更換1次，待培養(yǎng)至7、14 d后終止培養(yǎng)，檢測3T3細(xì)胞的ALP活性。提取細(xì)胞總蛋白，按照BCA試劑盒說明書步驟檢測總蛋白濃度。ALP活性定量采用日本W(wǎng)AKO公司的ALP檢測試劑盒，按照說明書步驟進行操作：向96孔板中加入100μL底物緩沖液，再分別加入20μL標(biāo)準(zhǔn)液或細(xì)胞裂解液，放入37℃烘箱孵育1 h；向96孔板每孔加入80μL反應(yīng)終止液，于酶標(biāo)儀中測定每孔在405 nm處的OD值。（2）3T3細(xì)胞基質(zhì)礦化的茜素紅染色及半定量分析。3T3細(xì)胞培養(yǎng)21 d后，吸去培養(yǎng)基，PBS漂洗3次后，4%多聚甲醛常溫下固定20 min，加入1 mL茜素紅染液染色15~20 min。鏡下觀察拍片后采用洗脫法進行半定量分析，步驟如下：在24孔板中，每孔加入1 mL洗脫液并上搖床以120 r/min搖勻至試樣上染料充分溶解，每孔取3份150μL洗脫液，轉(zhuǎn)入96孔板中，測定620 nm波長處OD值并使用空白洗脫液調(diào)零。（3）qPCR檢測3T3細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達。將3T3細(xì)胞按密度5×104個/孔接種于6孔板，分別培養(yǎng)7、14 d后提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qPCR法檢測成骨基因ALP、OCN、OPN、Col-1、Runx2mRNA表達水平，以GADPH為內(nèi)參。操作步驟同1.4，引物序列見表2。按照2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。實驗重復(fù)3次。

Tab.2 Amplification of osteogenic gene primers by qPCR表2 qPCR擴增成骨基因引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HA、si-HA納米粒子對巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)及炎性因子mRNA表達的影響 與Control組相比，HA組巨噬細(xì)胞M1表型因子iNOS及促炎因子TNF-α、IL-1βmRNA表達水平升高，M2表型因子Arginase及抗炎因子IL-10mRNA表達水平降低（P＜0.05）。si-HA組iNOS、TNF-α、IL-1βmRNA表達水平均低于Control組和HA組，Arginase、IL-10和IL-1ramRNA表達水平均高于Control組和HA組（P＜0.05）；IL-6mRNA表達水平低于HA組（P＜0.05），與Control組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

2.2 巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)對3T3細(xì)胞增殖能力的影響 各組3T3細(xì)胞在完全培養(yǎng)基和不同條件培養(yǎng)基培養(yǎng)1、3、7 d時的細(xì)胞增殖能力依次增強，組間多重比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。培養(yǎng)1 d時，各組細(xì)胞增殖能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；培養(yǎng)3、7 d時，si-HA+RAW組3T3細(xì)胞增殖能力明顯強于空白對照組、RAW組和HA+RAW組（P＜0.05），見表4。

2.3 巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)對3T3細(xì)胞成骨分化能力的影響

2.3.1 3T3細(xì)胞ALP活性的定量分析 3T3細(xì)胞在完全培養(yǎng)基和不同條件培養(yǎng)基培養(yǎng)7、14 d時，RAW組3T3細(xì)胞ALP活性與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；si-HA+RAW和HA+RAW組3T3細(xì)胞ALP活性均顯著強于空白對照組和RAW組，si-HA+RAW組3T3細(xì)胞ALP活性明顯強于HA+RAW組（P＜0.05），見表5。

Tab.3 Comparison of the mRNA expression levels of inflammatory factors between the three groups of macrophages表3 3組巨噬細(xì)胞炎性因子mRNA表達水平的比較 （n=3，x±s）

Tab.4 Comparison of the 3T3 cell growth after treatment with different conditioned medium between the four groups表4 不同條件培養(yǎng)基處理后3T3細(xì)胞生長情況比較（n=3，OD值，x±s）

Tab.5 Comparison of the ALP activity between the four groups of 3T3 cells表5 各組3T3細(xì)胞ALP活性的比較 （n=3，x±s）

2.3.2 3T3細(xì)胞基質(zhì)礦化的茜素紅染色及半定量分析結(jié)果 3T3細(xì)胞在完全培養(yǎng)基和不同條件培養(yǎng)基培養(yǎng)21 d后，HA+RAW組和si-HA+RAW組均有大量紅色鈣結(jié)節(jié)形成，空白對照組和RAW組中幾乎無著色的鈣結(jié)節(jié)，見圖1。半定量分析結(jié)果顯示，空白對照組、RAW組、HA+RAW組和si-HA+RAW組OD值分別為0.200±0.030，0.209±0.032，0.933±0.040和1.637±0.061，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=578.606，P＜0.01）。si-HA+RAW和HA+RAW組3T3細(xì)胞OD值高于空白對照組和RAW組，si-HA+RAW組3T3細(xì)胞OD值顯著高于HA+RAW組（P＜0.05）。RAW組與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

Fig.1 Images of calcium nodules 21 days after osteogenic differentiation(×200)圖1 成骨分化21 d后鈣結(jié)節(jié)的茜素紅染色（×200）

2.3.3 各組3T3細(xì)胞成骨相關(guān)基因mRNA表達水平變化 3T3細(xì)胞在完全培養(yǎng)基和不同條件培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d時，si-HA+RAW組3T3細(xì)胞ALP、Col-1、Runx2mRNA表達水平高于空白對照組、RAW組和HA+RAW組（P＜0.05），OPNmRNA表達水平與其他3組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；HA+RAW組ALP、Runx2mRNA表達水平高于空白對照組和RAW組（P＜0.05）。培養(yǎng)14 d時，si-HA+RAW組3T3細(xì)胞ALP、OCN、OPN、Col-1、Runx2mRNA表達水平均高于其他3組（P＜0.05）；HA+RAW組ALP、Runx2mRNA表達水平高于空白對照組和RAW組，OCNmRNA表達水平高于空白對照組，Col-1mRNA表達水平高于RAW組（P＜0.05），見表6。

Tab.6 Comparison of mRNA expression levels of bone related genes between the four groups表6 各組成骨相關(guān)基因mRNA表達水平的比較 （n=3，x±s）

3 討論

硅是結(jié)締組織發(fā)育和骨代謝中重要的微量元素。多項研究表明含硅的生物材料可促進成骨細(xì)胞分化，如含硅的磷灰石、生物活性玻璃和硅酸鈣水泥等［13-14］，但其刺激成骨的確切機制尚未明確。

有研究發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)參與骨缺損部位的骨形成過程，并發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［15-16］。外周巨噬細(xì)胞主要參與炎癥和宿主防御反應(yīng)，特別是機體固有免疫反應(yīng)［17］。當(dāng)骨修復(fù)材料植入缺損部位后可導(dǎo)致機體產(chǎn)生固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，過度的炎癥反應(yīng)可引起“異物反應(yīng)”，形成慢性炎癥以及纖維包裹，將“異物”與機體隔絕或者排出體外［18］。因此，機體反應(yīng)既可阻礙生物材料發(fā)揮成骨作用，也可通過調(diào)節(jié)成骨和破骨細(xì)胞的活性及分化而促進骨形成［19］，適當(dāng)控制免疫反應(yīng)是促進成骨的重要手段［20］。本研究從骨免疫學(xué)的角度對羥基磷灰石和si-HA納米粒子進行分析，通過體外細(xì)胞實驗研究巨噬細(xì)胞在不同材料懸液的作用下產(chǎn)生的免疫微環(huán)境對成骨過程的影響。

M1、M2是巨噬細(xì)胞的2種極化類型。M1又稱經(jīng)典性活化，分泌多種促炎細(xì)胞因子，包括炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-18），趨化因子，活性氧和氮中間產(chǎn)物等［21］；M2又稱替代性活化，主要通過分泌細(xì)胞因子，如纖維連接蛋白、IL-1β、IL-6、IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等，發(fā)揮抗炎及維持組織平衡功能［22］。巨噬細(xì)胞通過M1、M2極化表型分泌不同的炎性細(xì)胞因子調(diào)控炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠巨噬細(xì)胞在不同納米粒子的材料懸液中產(chǎn)生不同的極化狀態(tài)。si-HA能夠顯著抑制M1表型因子iNOS和促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的表達，進而抑制炎癥反應(yīng)。同時si-HA材料懸液顯著促進RAW細(xì)胞M2表型因子Arginase和抗炎因子IL-10和IL-1ra的表達，提示經(jīng)si-HA納米粒子刺激后，RAW細(xì)胞表現(xiàn)出向M2極化的趨勢。相反，在HA納米粒子作用下小鼠RAW巨噬細(xì)胞的基因表達傾向于促炎型，促炎基因iNOS、TNF-α和IL-1β的表達顯著上調(diào)，提示HA和si-HA懸液對巨噬細(xì)胞M1/M2極化產(chǎn)生了不同的調(diào)控作用。

目前對于巨噬細(xì)胞的不同表型對成骨的作用尚未達成共識。Chen等［23］研究認(rèn)為人巨噬細(xì)胞上清液可抑制間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）成骨分化的過程，主要是由于上清液中含有大量的TNF-α和IL-1β。Lee等［24］研究發(fā)現(xiàn)鈦顆粒活化的小鼠巨噬細(xì)胞抑制小鼠前成骨細(xì)胞成骨分化，主要是由于巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α可抑制Wnt和BMP2信號通路。M1型巨噬細(xì)胞啟動炎癥反應(yīng)，分泌大量的促炎因子，可抑制成骨分化；M2型巨噬細(xì)胞參與組織的后期修復(fù)，巨噬細(xì)胞適度地向M2極化可促進骨生成；然而也有研究表明M1型巨噬細(xì)胞具有促進骨生成的作用［25］。因此，本研究旨在探究在HA和si-HA納米粒子刺激下，巨噬細(xì)胞不同極化狀態(tài)所產(chǎn)生的免疫微環(huán)境對小鼠前成骨細(xì)胞的增殖和成骨分化能力的影響。

本研究結(jié)果顯示，si-HA+RAW組3T3細(xì)胞的增殖能力顯著高于其他3組，提示HA中摻入硅所刺激產(chǎn)生的微環(huán)境能更好地促進3T3細(xì)胞增殖，使細(xì)胞具有更高活力。

ALP是成骨細(xì)胞表型和早期成骨分化的典型標(biāo)志物，是檢測成骨細(xì)胞分化的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，3T3細(xì)胞采用完全培養(yǎng)基、RAW、HA+RAW和si-HA+RAW條件培養(yǎng)基培養(yǎng)7、14 d時，si-HA+RAW組和HA+RAW組3T3細(xì)胞ALP活性顯著高于空白對照組和RAW組，且si-HA+RAW組明顯高于HA+RAW組，提示si-HA+RAW條件培養(yǎng)基具有較強的刺激成骨作用。3T3細(xì)胞在成骨分化后期會出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)現(xiàn)象，這是成骨分化后期的另一重要標(biāo)志。本研究結(jié)果顯示，si-HA+RAW組和HA+RAW組3T3細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)形成顯著高于空白對照組和RAW組。另外，3T3細(xì)胞在完全培養(yǎng)基和不同條件培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d時，si-HA+RAW組3T3細(xì)胞ALP、Col-1、Runx2 mRNA表達水平高于其他3組；培養(yǎng)14 d時，si-HA+RAW組3T3細(xì)胞ALP、OCN、OPN、Col-1、Runx2 mRNA表達水平均高于其他3組。這些結(jié)果均提示在si-HA的刺激下，巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)可顯著促進3T3細(xì)胞的增殖與成骨分化。

綜上所述，si-HA納米粒子可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生較有利的骨免疫微環(huán)境，增強3T3細(xì)胞的增殖和成骨分化。