化學(xué)合成肽修飾鈦種植體表面的抗菌效果研究

耿紅娟，袁洋，尼娜△

目前，口腔種植技術(shù)因成功率、存活率高，已成為牙列缺失或缺損治療中不可或缺的修復(fù)方法。然而，口腔種植體周圍炎的發(fā)生率較高。種植體周圍炎是一種不可逆轉(zhuǎn)的炎癥病變，可引起種植體松動、脫落等漸進(jìn)性骨破壞，最終導(dǎo)致治療失敗［1］。因此，抑制種植體周圍炎是降低種植修復(fù)失敗率的關(guān)鍵。目前，對種植體表面進(jìn)行改性，獲得具有生物功能活性的種植體表面是減少種植體周圍炎發(fā)生的重要手段之一，也是牙齒種植修復(fù)領(lǐng)域研究的熱點［2-3］。近年來，抗生素的濫用造成了細(xì)菌耐藥性的增強(qiáng)，進(jìn)一步增加了種植體周圍炎的發(fā)生概率，而抗菌肽為一種不易致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的新型抗菌劑，受到廣泛關(guān)注［4-5］。本研究利用源于人類β防御素3（human β-defensin-3，hBD3）的序列片段（hBD3-1）對種植體表面進(jìn)行改性，觀察其能否抑制細(xì)菌生物膜形成，降低種植體周圍炎發(fā)生率，以期為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 KM-12C超聲波清洗器（廣州市科盟實驗儀器有限公司）；美普達(dá)UV-3300B紫外分光光度計（深圳中科先創(chuàng)科技有限公司）；Synergy HT酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；KS160A-2二氧化碳培養(yǎng)箱（上海冠森生物科技有限公司）；低速高溫離心機(jī)（德國EPPENDORF公司）。結(jié)合肽（TBP-1）和化學(xué)合成肽（TBP-1-hBD3-1）購自上海淘普生物科技股份有限公司；冰乙酸、無水乙醇、無菌去離子水、磷酸鹽緩沖液（PBS）、96孔板、比色皿購自上海生工生物工程股份有限公司；腦心浸液肉湯培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司；牙齦卟啉單胞菌（P.gingivalis）購自美國模式菌種收集中心。

1.2 鈦片樣本制作 將鈦片切割成直徑10 mm、厚度0.5 mm的圓形樣本100個，并依次使用100、240、400、600、800、1 000及1 200目的砂紙打磨，再依次用丙酮、乙醇和蒸餾水對各樣本進(jìn)行超聲清洗各30 min，經(jīng)室溫干燥、備用。

1.3 TBP-1-hBD3-1制備 委托上海淘普生物科技股份有限公司，將hBD3-1與結(jié)合肽（Ti-binding peptide-l，TBP-1）合成TBP-1-hBD3-1。質(zhì)譜分析法對TBP-1-hBD3-1進(jìn)行純度檢測（純度＞95%），高效液相色譜分析法對TBP-1-hBD3-1的特性進(jìn)行檢測。通過Peptide Calculator軟件分析TBP-1-hBD3-1的基本性質(zhì)。將TBP-1-hBD3-1作為溶質(zhì)溶解于PBS中，并配置成100、200、400、800、1 000及2 000 mg/L的抗菌肽溶液，備用。

1.4 TBP-1-hBD3-1抗菌特性的檢測

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)微量肉湯稀釋法檢測TBP-1-hBD3-1的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）100μL的P.gingivalis菌懸液（5×105CFU/mL）與相同體積的無菌PBS混合作為對照組；100μL菌懸液（5×105CFU/mL）再分別與等體積的不同劑量（100、200、400、800、1 000及2 000 mg/L）的TBP-1-hBD3-1溶液混合為實驗組；每組設(shè)3個復(fù)孔，接種于96孔板，置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，在厭氧的條件下（80%N2、10%CO2、10%H2）培養(yǎng)48 h。將完全抑制細(xì)菌生長的最小TBP-1-hBD3-1溶液濃度作為TBP-1-hBD3-1的MIC，并以此濃度為基礎(chǔ)配成≥MIC值的抗菌肽濃度，99.9%的細(xì)菌被殺死時的抗菌肽濃度即為MBC值。實驗重復(fù)3次。

1.4.2 微量滴定法檢測TBP-1-hBD3-1作用于P.gingivalis的生物膜實驗 將100μLP.gingivalis的菌懸液分別接種于含有100μL的PBS（生物膜對照組）和100μL的400 mg/L的TBP-1-hBD3-1溶液（生物膜實驗組）的96孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔；置于37℃的培養(yǎng)箱（80%N2、10%CO2、10%H2）中培養(yǎng)72 h；室溫下烘干20 min；95%甲醇固定，0.5%結(jié)晶紫染色，95%乙醇脫色，用酶標(biāo)儀分析生物膜波長600 nm處的光密度（OD600）值。實驗重復(fù)3次。

1.4.3 共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察TBP-1-hBD3-1黏附和細(xì)菌活性情況 用7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）標(biāo)記TBP-1-hBD3-1（呈藍(lán)色），以便觀察TBP-1-hBD3-1是否吸附在鈦片樣本表面。無TBP-1-hBD3-1處理的空白鈦片樣本為CLSM對照組；取無菌的鈦片浸入1.4.1實驗所得MIC TBP-1-hBD3-1溶液內(nèi)，在4℃環(huán)境下靜置2 h（CLSM實驗組）備用。取1 mL的P.gingivalis（5×105CFU/mL）菌懸液置于含有2組樣本的24孔板內(nèi)，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。用經(jīng)滅菌處理后的PBS緩慢沖洗樣本，將未黏附于表面的細(xì)菌去除，再置于未使用過的24孔板內(nèi)，用AO/EB染色劑染色，CLSM觀察樣本表面細(xì)菌黏附和細(xì)菌活性情況。每組實驗3次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）進(jìn)行表示，2組間比較用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TBP-1-hBD3-1的分子特征 Peptide Calculator軟件分析結(jié)果顯示，TBP-1-hBD3-1具有較好的溶解性及親水性，并有疏水性基團(tuán)，帶有一定的正電荷數(shù)（4+），見圖1。

Fig.1 Molecular characteristics of synthetic peptides圖1 TBP-1-hBD3-1的分子特征

2.2 TBP-1-hBD3-1的MIC、MBC及生物膜實驗結(jié)果 TBP-1-hBD3-1對P.gingivalis的MIC值和MBC值分別為400 mg/L和1 000 mg/L。與生物膜對照組OD600值（1.045±0.063）比較，生物膜實驗組（0.540±0.046）明顯降低（n=3，t=13.413，P＜0.05）。

2.3 TBP-1-hBD3-1吸附情況 CLSM對照組可見綠色的活菌覆蓋整個鈦樣本表面，CLSM實驗組可見紅色的死菌覆蓋了大部分鈦樣本表面，并可見藍(lán)色的TBP-1-hBD3-1緊密黏附于鈦樣本表面，見圖2。

Fig.2 The adsorption of TBP-1-hBD3-1 observed by confocal laser scanning microscope(AO/EB staining)圖2 共聚焦激光掃描顯微鏡觀察TBP-1-hBD3-1吸附情況（AO/EB染色）

3 討論

牙種植修復(fù)失敗的原因之一為種植體周圍炎，而細(xì)菌生物膜的形成又是種植體周圍炎的重要誘發(fā)因素［6］。目前，改變鈦種植體表面性質(zhì)、抑制細(xì)菌生物膜的形成和促進(jìn)骨結(jié)合是降低牙種植失敗率的一個重要策略［2-3］。研究表明，hBD3具有抗真菌、抗細(xì)菌、抗病毒等多種活性，細(xì)胞毒性較小，不易降解，對金黃色葡萄球菌也同樣具有抗菌活性［7］。因此，hBD3有望作為抗菌藥物而應(yīng)用于臨床，但其分子質(zhì)量較大，成本較高。研究顯示，hBD3-1序列片段具有抗炎和穿透細(xì)胞膜的特性［8］。另有研究顯示，TBP-1可直接吸附在鈦材料表面［9］；抗菌肽可隨著所帶正電核數(shù)的增加而增強(qiáng)其抗菌活性［10］；與無兩親性結(jié)構(gòu)的抗菌肽比較，具有兩親性結(jié)構(gòu)的抗菌肽在與靶膜作用時表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗菌活性［11］。Peptide Calculator軟件分析結(jié)果顯示，本研究中制備的TBP-1-hBD3-1具有優(yōu)良的溶解性、親水性，帶有疏水性基團(tuán)，并帶有正電荷數(shù)（4+），表明TBP-1-hBD3-1具有與抗菌相關(guān)的理化參數(shù)。MIC和MBC結(jié)果表明，TBP-1-hBD3-1對浮游狀態(tài)下的P.gingivalis具有一定的抗菌活性。

種植體表面細(xì)菌生物膜的形成是導(dǎo)致種植體周圍炎的主要生物學(xué)因素。本研究結(jié)果顯示，與生物膜實驗對照組相比較，TBP-1-hBD3-1作用于P.gingivalis生物膜72 h后表現(xiàn)出抗生物膜的特性，而CLSM結(jié)果顯示，CLSM對照組可見綠色的活菌覆蓋整個樣本表面，CLSM實驗組可見紅色的死菌覆蓋了大部分樣本表面并可見藍(lán)色的TBP-1-hBD3-1仍然緊密地附著于樣本表面，證實了TBP-1-hBD3-1既能夠修飾鈦材料表面，又能發(fā)揮抑制細(xì)菌和抗細(xì)菌生物膜形成的作用，考慮其機(jī)制可能與其具有親水性和疏水性基團(tuán)，帶有正電荷數(shù)（4+）有關(guān)。

綜上所述，TBP-1-hBD3-1能夠?qū)︹伔N植體表面進(jìn)行修飾，形成具有抗菌活性的種植體表面，并減少或抑制種植體表面細(xì)菌生物膜的形成，從而有可能用于臨床來降低種植體周圍炎的發(fā)生。然而，在口腔種植體表面，細(xì)菌生物膜的形成是由多種細(xì)菌參與完成。在本研究的抗菌活性實驗中只是針對具有代表性的單一菌種P.gingivalis，TBP-1-hBD3-1是否對其他細(xì)菌也具有抗菌作用以及其生物相容性如何，有待后續(xù)研究驗證。