M2型巨噬細胞旁分泌調控甲狀腺乳頭狀癌細胞生物學行為研究

龔麒麟 吳宇 劉輝

甲狀腺癌是近年來全球發病率上升最快的惡性腫瘤之一，美國甲狀腺癌的發病率平均每年增加3.6%[1]，在我國同樣增長迅速。2006年甲狀腺癌發病率在我國所有惡性腫瘤中位于第10 位之后，而2019年國家癌癥中心發布的數據顯示，甲狀腺癌已位于常見惡性腫瘤第7 位，女性常見惡性腫瘤第4位[2]。甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌最常見的病理類型，研究甲狀腺乳頭狀癌的發病機制具有重要意義。

腫瘤的發展與腫瘤所處的微環境密切相關。巨噬細胞是腫瘤微環境中重要的基質細胞,腫瘤相關巨噬細胞（Tumor-associated macrophages，TAMs）是浸潤于腫瘤組織周圍的巨噬細胞，與腫瘤發生、發展密切相關[3]。在正常生理情況下，巨噬細胞有M1、M2 型兩種激活狀態。TAMs 的表型和功能更傾向于M2 型巨噬細胞，因此，經常以M2 型巨噬細胞為對象研究TAMs 的致病過程[4，5]。

M2 型巨噬細胞與甲狀腺乳頭狀癌關系密切。研究發現M2 型巨噬細胞密度越高，甲狀腺乳頭狀癌分期越晚，預后越差[3]，但M2 型巨噬細胞對甲狀腺乳頭狀癌生物學行為的調控作用及其機制仍需深入研究。本研究探討M2 型巨噬細胞對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1 細胞增殖、侵襲、遷移能力的影響及其作用途徑。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞、人單核細胞系THP-1 細胞購于中國科學院上海細胞生物學研究所。CCK-8 試劑盒購自中國Biosharp 公司。SYBR Premix EX Taq 試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。PCR 引物由美國 Invitrogen(北京)公司合成。

1.2 細胞培養甲狀腺乳頭狀癌TPC-1 細胞加入含有1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM 培養基中，人單核細胞系THP-1 細胞加入含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基中，均于37℃、5%CO2孵箱中培養，2 天擴增1 次。

1.3 誘導、極化M2 型巨噬細胞每個含人單核細胞系THP-1 細胞培養皿加入5μl 佛波酯(PMA)，放入37℃、5%CO2孵箱中培養24h，誘導THP-1 細胞貼壁分化為未極化的巨噬細胞（M0）。然后加入重組人IL-4（1∶500）和重組人IL-13（1∶500）各5μl，混勻后繼續放入37℃、5%CO2孵箱中培養18h，分化為誘導極化的M2 型巨噬細胞。

1.4 M2 型巨噬細胞鑒定M2 型巨噬細胞的特點為高表達IL-10，精氨酸酶1（Arginase-1）活性增加。用RT-PCR 檢測未極化的巨噬細胞和誘導極化的巨噬細胞IL-10、Arginase-1。按Trizol 試劑盒步驟提取每組細胞的總RNA，使用 Primer Script Treagent Kit試劑盒將提取的RNA 逆轉錄成 cDNA；再以cDNA為模板，使用 SYBR Premix EX Taq 試劑盒進行RTPCR。以β-actin 為內參，檢測IL-10、Arginase-1的表達。各目的基因擴增條件相同，95℃預變性10min，95℃變性15s，60℃復制60s，95℃延伸15s，共40 個循環。結果采用2-ΔΔCT方法分析，引物序列見表1。

表1 引物設計

1.5 獲得條件培養基及分組將M2 型巨噬細胞在無血清DMEM 中培養12h，然后通過0.22μm 濾膜過濾以除去細胞并收集條件培養基（CM）。設置研究組及對照組。研究組將TPC-1 細胞置入含CM的無血清DMEM 中培養。對照組將TPC-1 細胞置入不含CM 的無血清DMEM 中培養。研究組及對照組均置于37℃、5% CO2培養箱中培養24h。

1.6 細胞侵襲、增殖和遷移實驗采用CCK-8 法檢測細胞增殖能力：將研究組及對照組細胞接種于96孔細胞培養板中，細胞濃度為1×105個/ml，每孔加入100μl 細胞懸液(每組設置6 孔重復)。37℃、5% CO2培養箱中培養24h 后，加入CCK-8 進行細胞增殖檢測，2h 內讀取OD450 值。

采用Transwell 法檢測細胞侵襲能力：研究組及對照組細胞培養24h 后，先消化細胞，然后用無血清培養基洗3 次，配成5×105個/ml 細胞懸液，在上室中加入100μl 細胞懸液(3 個室)，在下室中加入500μl 完全培養基，培養24h 后用多聚甲醛固定，擦去上室內基質膠和細胞，1%結晶紫乙醇溶液孵育染色，顯微鏡下（×100）隨機計數16 個視野內的膜下細胞數。

采用劃痕法檢測細胞遷移能力：將研究組及對照組細胞分別接種于6 孔板中，每個孔中加入約3.5×106個細胞。用記號筆在6 孔板背后用直尺劃橫線，每孔劃3 條。細胞貼壁后用槍頭和直尺垂直于背后的橫線劃痕， PBS 洗細胞2～3 次，去除劃下的細胞，加入無血清培養基。放入37℃、5% CO2培養箱，培養0h、24h、48h 時各拍照6 張。

1.7 統計學分析采用SPSS 20.0 統計學軟件分析數據，計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料用n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 M2型巨噬細胞誘導及鑒定經RT-PCR檢測，誘導極化的THP-1 細胞中IL-10 表達量為2.58±0.36， Arginase-1 含量為3.79±0.45；未極化的THP-1 中IL-10 表達量為0.92±0.11，Arginase-1 含量為1.20± 0.23。誘導極化的巨噬細胞IL-10、Arginase-1 表達均高于未極化的巨噬細胞，兩者差異有統計學意義（t=9.894，P=0.000；t=11.427，P=0.000）。結果顯示誘導極化后的THP-1 細胞高表達IL-10、Arginase-1，符合M2 型巨噬細胞表型特征。

2.2 M2 型巨噬細胞對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1 細胞增殖能力的影響采用CCK-8 法檢測細胞增殖能力。結果顯示：研究組和對照組OD450 值分別為1.32±0.70、0.85±0.57，研究組OD450 值高于對照組，差異有統計學意義（t=11.869，P=0.000）。表明研究組細胞增殖能力強于對照組。

2.3 M2 型巨噬細胞對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1 細胞侵襲能力的影響采用Transwell 法檢測細胞侵襲能力。結果顯示：研究組和對照組的穿膜細胞數分別為（264.20±43.22）個、（138.60±29.99）個，研究組穿膜細胞數多于對照組（見圖1），差異有統計學意義（t=5.339，P=0.01）。表明研究組細胞侵襲能力強于對照組。

圖1 Transwell 法檢測細胞侵襲能力(×100)

2.4 M2 型巨噬細胞對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1 細胞遷移能力的影響采用劃痕法檢測細胞增殖力。結果顯示：研究組和對照組的遷移距離分別為（255.94±35.10）μm、（167.58±33.26）μm，研究組細胞遷移距離大于對照組（見圖2），差異有統計學意義（t=4.086，P=0.04）。表明研究組細胞遷移能力強于對照組。

圖2 劃痕法檢測細胞遷移能力(×100)

3 討論

巨噬細胞是腫瘤微環境中的重要細胞，在某些腫瘤中可達到腫瘤微環境的50%[6]。在正常生理情況下，巨噬細胞有兩種極化狀態類型：M1 型巨噬細胞為經典活化型巨噬細胞，M2 型巨噬細胞為替代活化型巨噬細胞。M1 型巨噬細胞可由脂多糖（Lipopolys accharide，LPS）、干擾素γ（Interferon-γ，IFN-γ）和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GMCSF）刺激經典活化而來，它的特征是高表達IL-1β、TNF、IL-12 和IL-18，低表達IL-10。可抑制腫瘤、產生促炎細胞因子、介導對病原體的抗性并表現出強大的殺菌能力[7]。與經典途徑相反的途徑激活的巨噬細胞被稱為 M2 型巨噬細胞，CSF-1、IL-4、IL-10、轉化生長因子β（TGF-β）、IL-13、真菌和蠕蟲感染之類的刺激有利于 M2 型巨噬細胞激活。M2 型巨噬細胞的特征是高表達IL-10，Arginase-1活性增加，低表達IL-12、IL-13[8]。M2 型巨噬細胞在促進腫瘤發生、血管生成、細胞基質重塑及過敏性疾病反應中起重要作用[9]。TAMs 是浸潤在腫瘤周圍的巨噬細胞，嚴格意義上來說，它并非巨噬細胞的一個亞群，因為這些細胞在穩態環境中并不存在，但在許多腫瘤中可以觀察到。TAMs 與多種腫瘤的發生、增殖、侵襲和轉移有關。研究發現，在大多數人和鼠的腫瘤組織中，TAMs 通常具有M2 型巨噬細胞的表型特征，因此可以通過研究M2 型巨噬細胞分析TAMs 的作用[10～12]。

M2 型巨噬細胞與乳腺癌[13]、肝癌[14]、結腸癌[15]等多種腫瘤的發生、增殖、侵襲和轉移有關。動物模型也已證實，M2 型巨噬細胞減少與抑制腫瘤生長和轉移相關[11]。M2 型巨噬細胞與甲狀腺乳頭狀癌的關系同樣密切。有組織學研究發現，高密度的M2 型巨噬細胞與甲狀腺乳頭狀癌的高侵襲性、淋巴結轉移數量多和TNM 分期晚有關，且M2 型巨噬細胞密度越高，癌癥相關生存時間越短[16]。但在甲狀腺癌細胞學上，相關研究甚少。本研究通過將M2 型巨噬細胞條件培養基與甲狀腺乳頭狀癌TPC-1 細胞共培養，檢測癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力，發現在M2 型巨噬細胞條件培養基刺激下，TPC-1 細胞增殖、侵襲及遷移能力增加。本研究細胞學實驗證實了M2 型巨噬細胞可以促進甲狀腺乳頭狀癌TPC-1 細胞增殖、侵襲及遷移，可與上述學者在組織學上發現的結果相互印證[11，13～16]。本研究中TPC-1 細胞增殖、侵襲及遷移能力的增強是在去除M2 型巨噬細胞的條件培養基刺激下所致，因此進一步提示M2 型巨噬細胞促腫瘤作用是通過旁分泌相關細胞因子完成。

M2 型巨噬細胞通過旁分泌細胞因子調節腫瘤生物學行為在其他類型的腫瘤中已有發現，有學者在小鼠模型中發現巨噬細胞分泌的TNF-α 和IL-6 與結腸癌浸潤增加有關[17]。M2 型巨噬細胞分泌基質金屬蛋白酶9（MMP-9）會促進皮膚鱗癌的浸潤[18]。在人乳腺癌細胞中發現，M2 型巨噬細胞表達表皮生長因子 (EGF) 促進乳腺癌細胞的侵襲，而乳腺癌細胞產生的CSF-1 會促進巨噬細胞高表達EGF，從而形成一個惡性循環[19]。但關于M2 型巨噬細胞是通過旁分泌哪些細胞因子調控甲狀腺癌細胞生物學活性，目前國內外相關研究較少。有學者在PTC 的M2 型巨噬細胞培養基中發現趨化因子8（CXCL8）升高，而用CXCL8 抗體中和培養基后，PTC 細胞侵襲性降低，推斷M2 型巨噬細胞可能通過CXCL8 旁分泌作用促進PTC 細胞轉移[20]。但CXCL8 并非巨噬細胞分泌的特有細胞因子，內皮細胞及正常或惡性的甲狀腺濾泡細胞均能分泌[21～23]。因此CXCL8 可能并非M2 型巨噬細胞調控甲狀腺癌細胞轉移的主要細胞因子。M2 型巨噬細胞促進甲狀腺癌進展的分子機制仍未明確。

綜上所述，本研究在體外細胞學層面證實了M2 型巨噬細胞可以促進甲狀腺乳頭狀癌TPC-1 細胞的增殖、侵襲及遷移，且此作用是通過旁分泌細胞因子實現。但M2 型巨噬細胞調控甲狀腺癌細胞生物學行為的具體細胞因子及其機制仍需后續實驗進一步研究。