三陰性乳腺癌患者超聲造影征象及其與抑癌蛋白P53、細(xì)胞角蛋白5/6的關(guān)系*

陳霞，鄧晶，栗翠英，葉新華

（1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院 超聲診斷科，江蘇 南京211100；2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 超聲醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京210029）

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）是一類(lèi)具有高侵襲性、高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移特征的異質(zhì)性惡性腫瘤，占所有乳腺癌類(lèi)型的12%～20%[1]。TNBC 對(duì)內(nèi)分泌和靶向治療藥物不敏感，缺乏統(tǒng)一的治療方案，患者預(yù)后差、病死率高[2]。P53 是一種腫瘤抑制蛋白，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡和DNA 修復(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，P53突變可導(dǎo)致異常細(xì)胞增殖和腫瘤進(jìn)展[3]。細(xì)胞角蛋白5/6（cytokeratin 5/6, CK5/6）是TNBC 的特征性腫瘤免疫組織化學(xué)標(biāo)志物之一，可作為判斷TNBC 預(yù)后的重要預(yù)測(cè)因子[4]。超聲檢查是乳腺癌篩查、術(shù)前診斷的常用影像學(xué)方法，超聲造影通過(guò)實(shí)時(shí)觀察造影劑在腫塊內(nèi)血流灌注過(guò)程，分析病灶病變情況，為腫塊性質(zhì)鑒別提供可靠影像數(shù)據(jù)支撐[5]。TNBC 超聲造影征象與P53、CK5/6 表達(dá)的關(guān)系尚不清楚，分析其關(guān)系有助于提高臨床診斷水平。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2014年7月—2020年6月于南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院和南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科行乳腺超聲造影的98 例TNBC 患者作為研究組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者接受手術(shù)治療，術(shù)后病理組織學(xué)診斷為T(mén)NBC，參考《中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌診治指南與規(guī)范（2015 版）》[6]診斷標(biāo)準(zhǔn)；②女性患者，年齡≥18 周歲；③超聲造影圖像清晰，結(jié)果完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①Luminal 型、Her-2 型等其他類(lèi)型乳腺癌；②合并其他部位惡性腫瘤；③男性患者。研究組患者年齡46～63 歲，平均（55.23±7.31）歲；腫塊直徑2～5 cm，平均（3.23±0.61）cm。另選取同期本院收治的103 例其他分子分型乳腺癌患者作為對(duì)照組，均確診為乳腺癌，免疫組織化學(xué)鑒別為L(zhǎng)uminal 型、Her-2 陽(yáng)性乳腺癌。對(duì)照組患者年齡42～65 歲，平均（55.61±7.07）歲；腫塊直徑2～6 cm，平均（3.29±0.75）cm。兩組年齡、腫塊直徑比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 乳腺超聲造影

患者均采用超聲診斷儀（意大利百勝集團(tuán)）行乳腺超聲造影檢查，常規(guī)線(xiàn)陣探頭LA523 型，頻率4～13 MHz，造影線(xiàn)陣探頭LA522 型，頻率3～9 MHz。患者仰臥雙手抱頭暴露雙乳及腋下，涂耦合劑，以乳頭為中心行放射狀掃查，確定病灶位置、大小、形態(tài)、縱橫比、邊緣、內(nèi)部微鈣化、后方回聲、血流信號(hào)。血流信號(hào)采用Adler 半定量法[7]分級(jí)，0 級(jí)：無(wú)血流信號(hào)；Ⅰ級(jí)：1 或2 處點(diǎn)狀或細(xì)桿狀血流；Ⅱ級(jí)：長(zhǎng)度大于病灶半徑的1 條血流或見(jiàn)幾條細(xì)小血流；Ⅲ級(jí)：2 條長(zhǎng)度大于病灶半徑的血流或≥5 處點(diǎn)狀血流。選定病灶最大切面和血流最豐富切面，保持患者體位和探頭位置不變，經(jīng)肘靜脈通道團(tuán)注六氟化硫微泡（聲諾維，上海博萊科信誼藥業(yè)有限責(zé)任公司）懸液（59 mg 聲諾維+5 ml 生理鹽水）1.2 ml，推注生理鹽水5 ml 沖管。啟動(dòng)增強(qiáng)圖像，觀察病灶內(nèi)造影劑走向和分布，直到增強(qiáng)程度減弱至接近造影前水平，儲(chǔ)存動(dòng)態(tài)圖像。采用雙盲法由超聲科2 位主治醫(yī)師參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行評(píng)估，內(nèi)容包括增強(qiáng)水平（高增強(qiáng)、等/低/無(wú)增強(qiáng)）、增強(qiáng)后結(jié)節(jié)范圍擴(kuò)大情況、有無(wú)充盈缺損、有無(wú)均勻增強(qiáng)、有無(wú)穿支血管等。雙方不一致或不能確定的項(xiàng)目由主任醫(yī)師參與討論后確定結(jié)果。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)P53、CK5/6的表達(dá)

取兩組患者術(shù)中切除的TNBC 乳腺癌組織標(biāo)本各0.2 g，固定包埋后制成4 μm 切片，經(jīng)脫蠟，乙醇梯度水化，高壓，加入1%標(biāo)準(zhǔn)馬血清稀釋?zhuān)?℃冰箱過(guò)夜，PBS 沖洗后加入P53、CK5/6 抗體。再經(jīng)蘇木精復(fù)染、乙醇梯度脫水干燥、二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固后由病理科2 位主治醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行審片。根據(jù)染色密度評(píng)分（無(wú)著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分）和陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分（≤25%計(jì)1 分，>25%～50%計(jì)2 分，> 50%～75%計(jì)3 分，> 75%計(jì)4 分），計(jì)算免疫組織化學(xué)染色評(píng)分，免疫組織化學(xué)染色評(píng)分等于染色密度評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分乘積，≥4 分為陽(yáng)性，<4 分為陰性[9]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 兩組患者超聲征象比較

兩組患者腫塊形態(tài)、邊緣、微鈣化、后方回聲、血流分級(jí)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），研究組腫塊形態(tài)規(guī)則、后方回聲增強(qiáng)、血流Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)比例患者多于對(duì)照組，邊緣模糊、有微鈣化比例患者少于對(duì)照組（P<0.05）。兩組腫塊直徑、縱橫比比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1和圖1、2。

表1 兩組患者超聲征象比較 例（%）

圖1 研究組患者二維超聲征象

圖2 對(duì)照組患者二維超聲征象

2.2 兩組患者超聲造影征象比較

兩組患者增強(qiáng)程度、增強(qiáng)后結(jié)節(jié)范圍擴(kuò)大、充盈缺損、均勻增強(qiáng)比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），研究組高增強(qiáng)、增強(qiáng)后結(jié)節(jié)范圍擴(kuò)大不明顯、有充盈缺損患者多于對(duì)照組，有均勻增強(qiáng)患者少于對(duì)照組。兩組患者有無(wú)穿支血管比較，χ2檢驗(yàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2和圖3、4。

表2 兩組患者超聲造影征象指標(biāo)比較 例（%）

圖3 研究組患者超聲造影征象圖

圖4 對(duì)照組患者超聲造影征象圖

2.3 不同超聲征象TNBC患者的P53、CK5/6陽(yáng)性率比較

TNBC患者P53陽(yáng)性表達(dá)74例，陽(yáng)性率為75.51%，CK5/6 陽(yáng)性表達(dá)60 例，陽(yáng)性率為61.22%。不同血流分級(jí)患者P53 陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），血流分級(jí)Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)患者的P53 陽(yáng)性率高于血流分級(jí)0 級(jí)、I 級(jí)患者。邊緣清晰與邊緣模糊患者的CK5/6 陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），邊緣清晰患者的CK5/6 陽(yáng)性率高于邊緣模糊患者。TNBC 患者其余各指標(biāo)的P53 陽(yáng)性率、CK5/6 陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表3 和圖5、6。

圖5 TNBC患者乳腺組織P53的表達(dá)

圖6 TNBC患者乳腺組織CK5/6的表達(dá)

2.4 不同超聲造影征象TNBC 患者的P53、CK5/6陽(yáng)性率比較

不同增強(qiáng)程度患者的P53 陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），高增強(qiáng)患者的P53 陽(yáng)性率低于等/低/無(wú)增強(qiáng)患者，增強(qiáng)后結(jié)節(jié)范圍擴(kuò)大是否明顯患者的CK5/6 陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），增強(qiáng)后結(jié)節(jié)范圍擴(kuò)大不明顯患者的CK5/6 陽(yáng)性率高于增強(qiáng)后結(jié)節(jié)范圍擴(kuò)大明顯患者。TNBC患者其余各指標(biāo)的P53陽(yáng)性率、CK5/6陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表4。

表3 不同超聲征象TNBC患者的P53、CK5/6陽(yáng)性率比較 例（%）

表4 不同超聲造影征象TNBC患者的P53、CK5/6陽(yáng)性率比較 例（%）

3 討論

乳腺癌是全世界發(fā)病率最高的女性惡性腫瘤，不同類(lèi)型乳腺癌臨床和分子生物學(xué)特征不同，治療反應(yīng)性、預(yù)后也不盡相同。與其他分子分型乳腺癌比較，TNBC 患者侵襲性更高，生存時(shí)間更短，40%的TNBC 患者于診斷后5年內(nèi)死亡[10-11]。因此早期識(shí)別和診斷TNBC 是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。

超聲造影是一種純血池顯像技術(shù)，造影劑微泡直徑小，幾乎和血細(xì)胞相近，能隨血液循環(huán)分布到全身微小血管，微泡造影劑可增加靶組織和周?chē)M織的聲阻抗差異提高圖像分辨率，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)顯示靶組織的血流灌注特點(diǎn)，在乳腺癌的診斷、療效評(píng)估、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移判定中有較高價(jià)值[12]。本研究發(fā)現(xiàn)TNBC 超聲征象與其他分子分型乳腺癌存在一定差異性，表現(xiàn)為T(mén)NBC 多形態(tài)規(guī)則，邊緣清晰，后方回聲增強(qiáng)，血流分級(jí)較高，同時(shí)內(nèi)部微鈣化少見(jiàn)。張慧等[13]、馬文娟等[14]同樣也發(fā)現(xiàn)TNBC 腫塊形態(tài)更規(guī)則，邊界毛刺更少。TNBC 后方回聲增強(qiáng)原因與內(nèi)部成分有關(guān)，當(dāng)腫塊成纖維細(xì)胞含量增加時(shí)，對(duì)超聲波吸收能力增強(qiáng)，導(dǎo)致腫塊后方衰減，反之則增強(qiáng)[15-16]。超聲造影征象比較，TNBC 超聲增強(qiáng)后結(jié)節(jié)范圍擴(kuò)大不明顯，造影劑在結(jié)節(jié)內(nèi)分布不均勻，內(nèi)部存在充盈缺損。其他分子分型乳腺癌超聲增強(qiáng)后結(jié)節(jié)內(nèi)部分布尚均勻，內(nèi)部充盈缺損較少，增強(qiáng)后結(jié)節(jié)范圍擴(kuò)大明顯。其原因?yàn)楦呶⒀苊芏瓤赡軐?dǎo)致增強(qiáng)后結(jié)節(jié)內(nèi)回聲不均勻[17]，出現(xiàn)充盈缺損的原因?yàn)閻盒猿潭雀叩哪[瘤新生血管多分布于腫瘤邊緣，由于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)快，導(dǎo)致新生血管難以滿(mǎn)足腫瘤細(xì)胞需求，發(fā)生局部缺血壞死[18]，造影時(shí)出現(xiàn)充盈缺損。張雪松等[19]指出充盈缺損與雌激素受體陰性表達(dá)有關(guān)，但尚不支持充盈缺損可作為T(mén)NBC 的診斷依據(jù)。增強(qiáng)后結(jié)節(jié)范圍擴(kuò)大不明顯可能與癌灶內(nèi)含大量結(jié)締組織和纖維組織，質(zhì)地硬，影響新生血管生成有關(guān)[20]。

為更好地了解超聲造影特征的意義，提高診斷效率，有必要關(guān)注超聲造影征象與乳腺癌分子標(biāo)志物的關(guān)系。P53 被稱(chēng)為抑癌蛋白，具有調(diào)控細(xì)胞周期、DNA 復(fù)制作用，P53 突變或聚集時(shí)會(huì)失去原有功能，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展和生長(zhǎng)。P53 在TNBC 中表達(dá)上調(diào)，且與腫瘤分化程度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)相關(guān)[21]。本研究結(jié)果表明，P53 表達(dá)與TNBC 腫塊結(jié)節(jié)血流信號(hào)分級(jí)、高增強(qiáng)有關(guān)，分析原因?yàn)镻53陽(yáng)性表達(dá)可促使腫瘤細(xì)胞增殖和新生血管生成[22]，在超聲影像學(xué)表現(xiàn)為病灶血供豐富，造影時(shí)出現(xiàn)高增強(qiáng)。CK5/6 是腫瘤免疫組織化學(xué)標(biāo)志物，在尿路上皮腫瘤[23]、TNBC[24]、肺鱗癌[25]等多種惡性腫瘤中呈陽(yáng)性表達(dá)，CK5/6 陽(yáng)性表達(dá)與TNBC 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ki-67 表達(dá)有關(guān)[24]。本研究中CK5/6 陽(yáng)性表達(dá)率為61.22%，CK5/6 陽(yáng)性表達(dá)與邊界清晰，增強(qiáng)后結(jié)節(jié)范圍擴(kuò)大不明顯有關(guān)，楊潔等[26]也指出CK5/6陽(yáng)性表達(dá)的TNBC 結(jié)節(jié)邊界多清晰，內(nèi)部回聲多不均勻。CK5/6 陽(yáng)性表達(dá)者增強(qiáng)后結(jié)節(jié)范圍擴(kuò)大不明顯的原因可能為：CK5/6 的陽(yáng)性表達(dá)代表腫瘤增殖力越強(qiáng)，因此病灶密度偏大，進(jìn)而影響造影劑在血管內(nèi)充盈。以上結(jié)果說(shuō)明P53、CK5/6 表達(dá)與TNBC 超聲造影表現(xiàn)具有一定關(guān)系，與P53、CK5/6相關(guān)的影像征象可為臨床診療提供依據(jù)。

綜上所述，TNBC 與其他分子分型乳腺癌患者超聲二維和造影征象均存在明顯差異，TNBC 外觀缺乏惡性征象，但血流分級(jí)偏高，造影后呈高增強(qiáng)，增強(qiáng)后結(jié)節(jié)范圍擴(kuò)大不明顯，且可出現(xiàn)充盈缺損。P53 陽(yáng)性表達(dá)者血流信號(hào)分級(jí)偏高，造影后高增強(qiáng)，而CK5/6 陽(yáng)性表達(dá)者腫塊邊界清晰，增強(qiáng)后結(jié)節(jié)范圍擴(kuò)大不明顯。與P53、CK5/6 表達(dá)相關(guān)超聲造影征象有望作為鑒別TNBC 的參考指標(biāo)。