短時(shí)間吸入不同濃度七氟醚對(duì)幼鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

蕭治恒，吳論，彭學(xué)強(qiáng)，趙立梅，劉鑒，梁鴻韜

（中山市中醫(yī)院，廣東 中山528400）

現(xiàn)階段，麻醉藥物神經(jīng)毒性是國(guó)際麻醉界的主要研究熱點(diǎn)之一，相關(guān)研究指出，相較于其他麻醉藥物，七氟醚效果更優(yōu)越，患者不良反應(yīng)更少，已在嬰幼兒手術(shù)麻醉中得到廣泛使用[1-4]。亦有報(bào)道表明，七氟醚可能提高嬰幼兒術(shù)后認(rèn)知異常發(fā)生率[5-6]。選擇何種濃度七氟醚開展嬰幼兒手術(shù)麻醉依然有待進(jìn)一步探討。本文以80 只SD 幼鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討短時(shí)間吸入不同濃度七氟醚對(duì)幼鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，以期為嬰幼兒患者七氟醚的應(yīng)用提供有效指導(dǎo)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

選取無(wú)特異病原體（specific-pathogen free，SPF）級(jí)雄性SD 幼鼠80 只[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0002，使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2013-00011]，均為1 個(gè)月齡，體重100～110 g，平均（105±5）g，均購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。選擇實(shí)驗(yàn)室平衡飼料喂養(yǎng)，使其自由進(jìn)食、飲水，控制光照與黑暗各12 h，濕度55%～58%，室溫22～25℃，確保飼養(yǎng)環(huán)境安靜。

1.2 試劑與儀器

七氟醚（上海恒瑞醫(yī)藥有限公司），麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀（美國(guó)Datex-Ohmeda 公司），Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置（上海海軟隆科技發(fā)展公司），F(xiàn)luo3-AM 熒光指示劑、Pluronic F-127（日本同仁化學(xué)研究所），激光共聚焦顯微鏡（型號(hào)：FV10i，日本奧林巴斯公司），流式細(xì)胞分析儀（型號(hào)：BD FACSAria，美國(guó)Bection Dickinson 公司）。

1.3 方法

1.3.1 幼鼠分組與模型復(fù)制實(shí)驗(yàn)開始前，所有幼鼠開展4 d 水迷宮學(xué)習(xí)訓(xùn)練，然后采取隨機(jī)數(shù)字表法將其分為4 組，每組20 只。對(duì)照組單純吸氧2 h，控制氧流量2.0 L/min；在和對(duì)照組幼鼠相同吸氧條件下，1%七氟醚組吸入1%七氟醚2 h，2%七氟醚組吸入2%七氟醚2 h，3%七氟醚組吸入3%七氟醚2 h，采用麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀進(jìn)行氣體濃度監(jiān)測(cè)，并使用揮發(fā)罐合理調(diào)控七氟醚具體吸入濃度。

1.3.2 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)幼鼠吸入結(jié)束后12 h，各組取5 只幼鼠開展Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)，讓其在水池里自由游泳60 s，詳細(xì)記錄其平臺(tái)象限停留時(shí)間及穿臺(tái)次數(shù)。

1.3.3 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining,HE）染色幼鼠吸入結(jié)束后12 h，各組取5 只幼鼠，采用多聚甲醛進(jìn)行心臟灌注，然后取出全腦制作石蠟切片，HE 染色后詳細(xì)觀察幼鼠海馬組織神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變情況；每只幼鼠選擇10 張切片，并對(duì)海馬神經(jīng)元凋亡詳細(xì)數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值。

1.3.4 細(xì)胞凋亡幼鼠吸入結(jié)束后12 h，各組取5只幼鼠斷頭處死，采取無(wú)菌手術(shù)器械將其大腦取出，于放置磷酸鹽緩沖液冰盤上進(jìn)行雙側(cè)海馬分離（3 min內(nèi)完成），然后制備單細(xì)胞懸液。采取錐蟲藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)，確保活細(xì)胞>95%。用2.5 ml 含有血清培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞重懸，獲得5×105個(gè)/ml的細(xì)胞濃度。在流式管里面加入100 μl 細(xì)胞懸液，再放入5 μl Annexin V 及10 μl 碘化丙啶溶液。置于室溫條件下避光反應(yīng)20 min，并于1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行凋亡測(cè)定。通過(guò)BD FACSDria Softwa 完成結(jié)果分析。

1.3.5 鈣離子濃度幼鼠吸入結(jié)束后12 h，各組取5 只幼鼠，斷頭取其海馬組織，制備單細(xì)胞懸液，制備細(xì)胞圖片，確保細(xì)胞貼壁。采取Hank 平衡鹽溶液對(duì)1 mmol/L Fluo3-AM 母液進(jìn)行稀釋，獲得5 μmol/L 工作液。加入該工作液5 μmol/L 及0.05%Pluronic F-127，有效覆蓋細(xì)胞。持續(xù)孵育45 min后用Hank 平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞3 次，有效去除工作液。然后于培養(yǎng)箱里避光孵育10 min。采用75%酒精持續(xù)浸泡5 min，使用處理過(guò)的蓋玻片將其輕輕蓋上，防止產(chǎn)生氣泡。在激光共聚焦顯微鏡相應(yīng)樣品小槽里放置上述負(fù)載完成后的細(xì)胞涂片。控制激發(fā)光488 nm 及發(fā)射光530 nm。于低倍鏡下發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞（見圖1），再于×40 高倍物鏡下完成掃描拍照。通過(guò)熒光強(qiáng)度變化間接反映鈣離子水平的變化（見圖2）。

圖1 海馬神經(jīng)元選定圖 （×10）

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

各組平臺(tái)象限停留時(shí)間、穿臺(tái)次數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），2%七氟醚組、3%七氟醚組平臺(tái)象限停留時(shí)間較對(duì)照組縮短（P<0.05），穿臺(tái)次數(shù)較對(duì)照組減少（P<0.05）。見表1。

表1 各組Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 （n=5，±s）

表1 各組Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 （n=5，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P <0.05；②與1%七氟醚組比較，P <0.05。

組別對(duì)照組1%七氟醚組2%七氟醚組3%七氟醚組F 值P 值平臺(tái)象限停留時(shí)間/s 26.54±2.87 24.07±2.68 12.50±1.49①②12.38±1.46①②56.839 0.000穿臺(tái)次數(shù)1.85±0.21 1.69±0.20 0.75±0.08①②0.67±0.07①②79.637 0.000

2.2 各組HE染色結(jié)果比較

對(duì)照組、1%七氟醚組、2%七氟醚組及3%七氟醚組的凋亡神經(jīng)元數(shù)目分別為（1.92±0.22）個(gè)/視野、（2.14±0.25） 個(gè)/視 野、（38.57±4.16） 個(gè)/視 野 及（40.35±4.38）個(gè)/視野，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=56.839，P=0.000），2%七氟醚組、3%七氟醚組較對(duì)照組增加（P<0.05）。見圖3。

2.3 各組海馬神經(jīng)元凋亡率比較

各組早期凋亡率、晚期凋亡率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；2%七氟醚組、3%七氟醚組較對(duì)照組增加（P<0.05）。見表3。

2.4 各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度、鈣離子濃度比較

各組熒光強(qiáng)度、鈣離子濃度比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；2%七氟醚組、3%七氟醚組熒光強(qiáng)度較對(duì)照組增加（P<0.05），鈣離子濃度較對(duì)照組升高（P<0.05）。見表4。

3 討論

圖2 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度圖

圖3 各組海馬組織神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變 （HE×400）

表3 各組海馬神經(jīng)元凋亡率比較 （n=5，%，±s）

表3 各組海馬神經(jīng)元凋亡率比較 （n=5，%，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P <0.05；②與1%七氟醚組比較，P <0.05。

組別對(duì)照組1%七氟醚組2%七氟醚組3%七氟醚組F 值P 值早期凋亡率11.23±1.28 12.58±1.30 24.36±3.78①②26.85±3.81①②39.773 0.000晚期凋亡率8.12±0.93 9.26±1.05 17.38±1.87①②19.36±2.14①②63.928 0.000

表4 各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度、鈣離子濃度比較 （n=5，±s）

表4 各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度、鈣離子濃度比較 （n=5，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P <0.05；②與1%七氟醚組比較，P <0.05。

組別對(duì)照組1%七氟醚組2%七氟醚組3%七氟醚組F 值P 值熒光強(qiáng)度104.36±18.67 108.79±19.98 287.53±35.12①②296.37±36.54①②69.178 0.000鈣離子濃度/（nmol/L）79.50±11.28 82.36±11.94 185.37±26.85①②193.58±27.62①②44.936 0.000

有研究指出，幼鼠七氟醚最低肺泡的有效濃度為2.3%左右，吸入大約2.3%～3.5%七氟醚不會(huì)對(duì)其心血管功能與體內(nèi)重要器官組織血流灌注產(chǎn)生影響[7-8]。故筆者選擇吸入1%、2%與3%濃度的七氟醚開展研究。有報(bào)道認(rèn)為，吸入七氟醚能夠影響認(rèn)知功能，同時(shí)雄性幼鼠敏感性較雌性幼鼠更高[9-10]。故本研究全部選擇雄性幼鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)?zāi)芸陀^評(píng)價(jià)幼鼠認(rèn)知功能，具有操作簡(jiǎn)單、數(shù)據(jù)誤差較小等優(yōu)點(diǎn)。Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)還能夠檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能、學(xué)習(xí)記憶能力及感覺(jué)障礙等，客觀反映動(dòng)物認(rèn)知功能[11-12]。本研究中2%七氟醚組、3%七氟醚組平臺(tái)象限停留時(shí)間、穿臺(tái)次數(shù)明顯少于其余兩組，且2%七氟醚組與3%七氟醚組、對(duì)照組與1%七氟醚組比較無(wú)顯著差異，表明短時(shí)間吸入高濃度七氟醚可降低幼鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。HE 染色顯示，對(duì)照組與1%七氟醚組幼鼠神經(jīng)元細(xì)胞核體積較其他兩組大，同時(shí)具有規(guī)整性，短時(shí)間吸入高濃度七氟醚組幼鼠細(xì)胞皺縮，并且形態(tài)不規(guī)整，海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)明顯高于低濃度七氟醚組與對(duì)照組，提示高濃度七氟醚能夠?qū)е潞ｑR神經(jīng)元產(chǎn)生形態(tài)學(xué)改變，加快海馬神經(jīng)元凋亡。本研究結(jié)果顯示，2%七氟醚組、3%七氟醚組海馬神經(jīng)元早期凋亡率及晚期凋亡率明顯高于其余兩組，與徐桂萍等[13]研究結(jié)論相符。說(shuō)明短時(shí)間吸入2%或者3%七氟醚可提高幼鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞早期與晚期凋亡率。細(xì)胞之中鈣離子水平升高屬于細(xì)胞凋亡的重要條件，為進(jìn)一步明確短時(shí)間吸入不同濃度七氟醚是否會(huì)對(duì)細(xì)胞之中鈣穩(wěn)態(tài)造成影響，繼而導(dǎo)致其凋亡。本實(shí)驗(yàn)制備了幼鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞涂片，并進(jìn)行鈣熒光試劑負(fù)載，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡了解鈣離子變化。若實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)黏附細(xì)胞，則其將牢固黏附于相應(yīng)培養(yǎng)皿表面或者載玻片表面，而新鮮海馬組織獲得的單細(xì)胞懸液，其神經(jīng)元貼壁具有一定難度[14]。為有效解決該問(wèn)題，需要處理載玻片。一般通過(guò)聚乙烯醇、多聚賴氨酸或者蛋清等作為相應(yīng)粘貼劑，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需結(jié)合細(xì)胞特性合理選擇處理手段[15]。本研究通過(guò)多聚賴氨酸進(jìn)行載玻片，最終海馬神經(jīng)細(xì)胞貼壁。考慮各種細(xì)胞特性以及活性，確保實(shí)驗(yàn)染色成功具有較強(qiáng)技術(shù)性[16]。本研究最終確定所用Fluo 3-AM 濃度應(yīng)該為5 μmol/L，且持續(xù)孵育45 min。本研究顯示，2%七氟醚組、3%七氟醚組熒光強(qiáng)度、鈣離子濃度顯著高于1%七氟醚組與對(duì)照組，提示高濃度七氟醚導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的同時(shí)，細(xì)胞之中鈣離子增加，并由于鈣失衡導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，短時(shí)間吸入低濃度七氟醚麻醉不會(huì)對(duì)幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生嚴(yán)重影響，不代表幼鼠隨時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，不會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)行為改變，該觀點(diǎn)有待后續(xù)研究進(jìn)一步論證。

綜上所述，短時(shí)間吸入低濃度七氟醚并不會(huì)嚴(yán)重影響幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力，但是短時(shí)間吸入高濃度七氟醚能夠降低其認(rèn)知能力，提高海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，增加細(xì)胞之中鈣離子濃度，導(dǎo)致觸發(fā)凋亡。