胞外多糖對酸奶穩定性的研究

王 新，張居典，邵景海，秦 平

北大荒完達山乳業股份有限公司，黑龍江哈爾濱 150090

0 引言

乳酸菌胞外多糖是由乳酸菌發酵產生的，分泌于細胞外，常滲入培養基中的一種糖類化合物[1]。一般為黏液或莢膜多糖等水溶性多糖，是一種天然高分子聚合物[2]。作為一種新型的天然食品添加劑，乳酸菌胞外多糖因獨特的生理功能和產業潛力而備受研究者青睞。在生理功能上，胞外多糖具有良好的抗腫瘤、保護機體組織細胞、增強抵抗力和降低膽固醇等活性[3]。在物化特性上，研究表明，乳酸菌胞外多糖不僅能增加發酵乳的黏度，減少乳清析出，提高發酵乳的回復性和抗剪切力，還能顯著提高發酵乳的持水力[4]，提供蛋白的穩定性，是一種天然的增稠劑及穩定劑。胞外多糖在酸奶中的含量一般為50.0～2 700.0 mg/L，對酸奶質構的影響主要是胞外多糖的結構和含量與乳蛋白發生相互作用所致。本研究對不同菌種發酵過程中產生的胞外多糖含量及其對產品質構特性等方面的影響進行分析研究，為以后胞外多糖含量在酸奶中的研究與應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

全脂生牛乳，脫脂牛奶，白砂糖，試驗用發酵劑1號、2號、3號、4號、5號為不同型號發酵劑（成分均為保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌），乳酸菌培養基（MRS）等。

1.2 試驗器材

天平、攪拌槳、均質機、水浴鍋、恒溫培養箱、黏度計、離心機、pH計、紫外可見分光光度計、離心機、燒杯、稱量勺、溫度計等。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種胞外多糖產量的測定

（1）胞外多糖的分離

發酵劑1號、2號、3號、4號、5號，接種到經滅菌12%脫脂乳培養基中，在最適溫度37 ℃下培養24.0 h。接種2%的發酵液于MRS培養基中，在42 ℃下培養15.0 h。冷藏過夜。

取10 mL乳酸菌發酵液，4 000 r/min離心15 min，取上清液，用濃度為1 mol/L的NaOH將上清液pH值調至7.5，加入1/10體積的胰蛋白酶液（質量濃度為3 g/L，現配現用），40 ℃水浴酶解2.5 h。加入1/3體積Sevag液（氯仿∶正丁醇=3∶1，體積比），振搖30 min后，4 000 r/min 離心15 min，去除沉淀，重復1 次。加入3～5 倍體積的體積分數為95%的乙醇，充分振蕩（多糖呈絮狀沉淀析出），轉速為4 000 r/min離心15 min，得沉淀。將沉淀用丙酮洗滌脫水2 次，干燥得白色粉末即為多糖[5]。

（2）標準曲線繪制

將50 mg標準葡萄糖定容于500 mL容量瓶中。各種試劑按照表1所示順序加入后混勻，室溫放置顯色20 min后于490 nm波長下測定吸光值，以2.0 mL水按照同樣的顯色操作作為空白進行調零，橫坐標為多糖含量，單位為μg，縱坐標為光密度值，制作標準曲線[6]。

表1 葡萄糖標準曲線各濃度 單位：mL

（3）胞外多糖質量濃度的測定

采用苯酚-硫酸法測定胞外多糖質量濃度，用葡萄糖繪制標準曲線。胞外多糖含量的測定：準確吸取10 mL蒸餾水溶解胞外多糖樣品，吸取樣品溶液0.2 mL于試管中，然后按葡萄糖標準曲線制備步驟操作，測定樣品的吸光度，由標準曲線的回歸直線方程求出對應的糖質量濃度，再乘以樣品稀釋度即得各菌株的胞外多糖質量濃度。

1.3.2 酸奶樣品制作

使用標準化處理過的生牛乳，經6 5 ℃，180～200 bar均質處理、95 ℃，300 S殺菌、降溫至42 ℃，分別添加發酵菌種1號、2號、3號、4號、5號，發酵后測定試驗樣品狀態口感、黏度、持水性、耐熱性。

（1）產品狀態口感測定

樣品發酵后至pH值4.4，破乳降溫儲存，后熟12.0 h，由15 人組成品評小組，對產品的外觀狀態、口感進行評價計分（表2）。

表2 狀態口感評定標準

（2）產品黏度測定

產品發酵至pH值4.4，破乳降溫至25 ℃，BROOKFIELD DV3T 黏度計 S63 號轉子，轉速20 r/s，測定30 s時樣品的黏度。每個樣品做平行試驗3 次，取平均值。

（3）產品持水性測定

產品發酵至pH值4.4，破乳降溫至25 ℃，用離心管取樣品5.0 mL，并測定樣質量W1后，放入離心機以3 000 r/min離心20 min后，取出離心管靜置10min，除去上清液，測殘余物的質量W。酸奶持水力為：持水力（%）=（W/W1）×100%[7]。

（4）產品耐熱性比較

為驗證比較菌種產生胞外多糖對酸奶受熱保護性狀，在大量的前期試驗基礎上，采用生牛乳添加菌種進行發酵，發酵至pH值至4.4進行破乳降溫，降至25 ℃，采用75 ℃水浴對酸奶進行升溫殺菌，記錄酸奶升溫過程中的變化，比較酸奶殺菌過程中蛋白變性情況。

2 結果與分析

2.1 胞外多糖產量的測定

2.1.1 繪制葡萄糖標準曲線

以葡萄糖的含量作為橫坐標，490 nm下吸光值為坐標做出的標準曲線（圖1），該曲線與線型方程y=0.0086x-0.0031擬合良好，R2=0.9994，葡萄糖的含量為10～100 μg/mL。

圖1 葡萄糖繪制標準曲線

2.1.2 胞外多糖產量測定

采用苯酚-硫酸法進行測定5 種發酵菌種胞外多糖產量，如圖2所示。菌種4號胞外多糖產量最高，其胞外多糖產量為568.5 mg/L，其后依次為2號413.5 mg/L，1號352.3 mg/L，菌種3號284.3 mg/L，菌種5號174.8 mg/L。

圖2 不同菌種胞外多糖的產量

2.2 產品狀態口感測定

分析不同發酵菌種1號、2號、3號、4號、5號制得產品，對其乳感官狀態進行評價。品評小組從外觀狀態、口感、光滑度幾個方面對試驗產品進行品評，見表3。結果顯示，4號菌種發酵產品質構狀態評分最佳。結合上述，胞外多糖產量測定結果，說明胞外多糖能賦予產品更好的口感和狀態。

表3 狀態口感評定結果

2.3 產品產黏測定

分析不同發酵菌種1號、2號、3號、4號、5號對產品黏度的影響，從圖3可以看出，發酵菌種4號所制得酸奶黏度最高，為2 200 cp；其后依次為2號菌種1 900 cp、1號菌種1 600 cp、3號菌種1 400 cp、5號菌種1 000 cp。可以看出產品黏度與菌種胞外多糖產品正相關。胞外多糖可提高酸奶產品黏度，改善質地，是一種很好的天然生物增稠劑[8]。乳酸菌胞外多糖的種類非常多，結構也多變。其產品黏度的貢獻取決于產生胞外多糖的數量與胞外多糖的結構[9]。

圖3 不同菌種對應產品黏度的測定

2.4 產品持水性測定

分析不同菌種發酵產品持水性的比較。通過圖4可以看出，發酵菌種4號所制得酸奶持水能力最高，隨菌種產生胞外多糖能力的增加，產品持水性成增長趨勢。這可能是乳酸菌產生的EPS增加了發酵乳的持水性，減少了乳清析出。產EPS的發酵乳含有相對大的孔，EPS在這些微孔里使蛋白質網絡形成更厚、更濃密的蛋白質凝膠通道，這種結構更有利于防止發酵乳脫水析出[10]。

圖4 不同菌種對應產品持水性的測定

2.5 產品耐熱性比較

分析不同菌種發酵產品耐熱性的比較。通過圖5可以看出，發酵菌種4號所制得酸奶耐熱到75 ℃才開始有蛋白變性，隨菌種產生胞外多糖能力的增加，產品蛋白耐熱穩定性成增長趨勢。多糖和蛋白之間發生的相互作用主要有非共價作用和共價作用兩種[11]。非共價作用主要有強的靜電作用和弱的相互作用（氫鍵、范德華力、疏水相互作用等）。共價作用主要通過Maillard反應產生[12]。兩者的相互作用會改善蛋白質的溶解性、熱穩定性等[13]。

圖5 不同菌種對應產品耐熱性的測定

3 結論

乳酸菌胞外多糖可賦予發酵乳制品特殊物化特性，可改善酸奶的質地口感，增加酸奶的黏性、流變性，提高酸奶的持水性，防止乳清析出，增強酸奶的耐熱強度等。此外，胞外多糖還具有生物活性，如免疫活性、抗腫瘤等。在酸奶生產過程中，常出現黏度低、凝塊破碎和大量乳清析出等問題，這些問題可以通過使用高產胞外多糖的發酵菌種解決。使用高產胞外多糖的發酵劑生產出來的酸奶與低產胞外多糖的發酵劑相比，具有口感狀態好、黏度高、持水性好的優勢，在常溫酸奶的使用中，高產胞外多糖的發酵劑生產的酸奶具有耐熱性強的優勢。