基于響應面法結合熵權法多指標優選黃芪藥材產地加工炮制一體化工藝

吳紅偉，李東輝，邊甜甜，宋沁潔，李咸慰，李國峰，楊新榮，李越峰,3*

1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000

2.甘肅省中藥質量與標準研究重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

3.甘肅省中藥制藥工藝工程研究中心，甘肅 蘭州 730000

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao 或膜莢黃芪A.membranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根。具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌[1]等功效。現代研究表明，黃芪具有增強機體免疫力[2]、抗氧化[3]、保護肝腎[4]、利尿[5]及抗腫瘤[6]等藥理作用。黃芪藥材產地加工過程包括凈制、揉搓、干燥、悶潤、切制、干燥等多個工藝環節，加工過程較為繁瑣；同時，黃芪藥材產地加工多以傳統經驗為主，主觀性強，導致黃芪飲片質量不易控制[7]。此外，“發汗”也是中藥材產地加工的一種重要方法，現代研究表明，部分藥材經過發汗處理之后會對藥物的外觀性狀、化學成分以及藥理作用都會產生一定的影響[8-9]，黃芪藥材在產地加工過程中發汗與否觀點不一。

因此，本實驗在查閱相關文獻的基礎上[10-11]，通過前期預試驗研究，結果發現發汗過程會對黃芪質量產生影響，故將發汗過程納入黃芪產地加工一體化工藝中進行考察。基于此，本研究在傳統加工方式基礎上對其加以改進，其過程包括凈制、發汗、揉搓、切制、干燥。與傳統加工方法相比，該工藝能夠減少傳統加工炮制工藝中新鮮藥材的干燥過程及干燥后經水浸潤再切片的浸泡環節，降低從藥材到飲片的加工成本及藥材耗損；以黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、總黃酮、總多糖、水溶性浸出物的綜合評分為指標，運用Box-Behnken 響應面試驗設計方法，將黃芪產地加工與飲片炮制相結合，優選出黃芪產地加工炮制一體化的最佳工藝，為簡化加工工藝及提高黃芪飲片質量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 系列高效液相色譜儀、ELSD 蒸發光散射檢測器，美國Agilent 公司；HH-S28s 數顯恒溫水浴鍋，金壇市大地自動化儀器廠；OSB-2209 型旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司；L2-5K 型離心機，湖南可成儀器設備有限公司；HX502T 型電子分析天平，慈溪市天東衡器廠；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-power 型紫外分光光度計，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；766-6 型遠紅外輻射干燥箱，上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司。

1.2 試藥

黃芪藥材采自甘肅岷縣秦許鄉，經甘肅中醫藥大學中藥鑒定教研室王明偉副教授鑒定為蒙古黃芪A.membranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao，將黃芪藥材按不同產地加工方式處理，干燥、粉碎后過四號篩，置于干燥器中備用。

對照品黃芪甲苷（批號PS010428，質量分數≥98%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號PS000687，質量分數≥98%）、芒柄花苷（批號PS000674，質量分數≥98%）、毛蕊異黃酮（批號PS010251，質量分數≥98%）、D-葡萄糖（批號PS020418，質量分數＞98%）均購自成都普思生物科技有限公司；甲醇（色譜純，批號 20200302）、甲酸（色譜純，批號20171201）、正丁醇（分析純，批號20190801）、氨水（分析純，批號20200706），均購自天津市大茂化學試劑廠；水為娃哈哈純水。

2 方法與結果

2.1 不同加工方式處理制備黃芪飲片

不同含水量是指將新鮮黃芪藥材晾曬至一定含水量55%、50%、45%，然后進行后續發汗和揉搓處理；發汗是指將一定含水量的黃芪藥材進行發汗處理，發汗時長為1、2、3 d，黃芪發汗方法采用“普通發汗法”，即將失水黃芪藥材進行堆置處理，促其發熱，使黃芪藥材內部水分向外擴散[7]，發汗處理完成后攤開晾1 夜，然后進行揉搓處理。揉搓是指將一定含水量的黃芪藥材經過發汗處理后，進行揉搓處理，切制得到飲片，揉搓次數為1、2、3 次。干燥是指將經切制后的黃芪飲片利用遠紅外輻射干燥箱在不同溫度（45、50、55 ℃）下進行干燥。

2.2 高效液相色譜-蒸發光散射檢測器（HPLCELSD）法測定黃芪甲苷

2.2.1 色譜條件 色譜柱為HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-水（40∶60）為流動相；柱溫30 ℃；體積流量1 mL/min；進樣體積10 μL；蒸發光檢測器：漂移管溫40 ℃；載氣體積流量1.5 mL/min。黃芪甲苷對照品及黃芪樣品HPLC 色譜圖見圖1。

圖1 黃芪甲苷對照品 (a) 和黃芪樣品 (b) 的HPLCELSD 圖Fig.1 HPLC-ELSD of astragaloside IV reference substance(a) and Astragali Radix sample (b)

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇超聲使其完全溶解，制成質量濃度為2.5 mg/mL 的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備[12]取各樣品粉末約4 g，精密稱定，加甲醇40 mL，回流提取1 h，抽濾，重復以上操作2 次，合并濾液；減壓濃縮后加10 mL水溶解，加40 mL 水飽和的正丁醇萃取，重復操作2 次，合并萃取液并加入40 mL 氨試液萃取，重復操作2 次；將萃取液轉移至圓底燒瓶中，減壓濃縮，加甲醇定容至5 mL 量瓶中，0.45 μm 微孔濾膜濾過，備用。

2.2.4 線性關系考察 精密吸取黃芪甲苷對照品儲備液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.9 mL，至2 mL 量瓶中并用色譜甲醇定容至刻度。每個不同質量濃度的對照品溶液按“2.2.1”項下色譜條件進樣10 μL測定峰面積，對不同質量濃度的對照品溶液和峰面積求自然對數，以進樣量的對數對峰積對數進行線性回歸，繪制標準曲線，求得線性方程為Y＝1.680 7X＋2.166 1，R2＝0.999 5，表明黃芪甲苷在3.771～11.313 μg 線性范圍良好。

2.2.5 方法學考察 按照《中國藥典》2020年版[1]方法對實驗穩定性、重復性、精密度、加樣回收率進行考察，其RSD 值均分別為1.77%、1.35%、1.68%、1.17%，平均加樣回收率為97.00%。

2.3 高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLCDAD）法測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷

2.3.1 色譜條件 色譜柱為HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長260 nm；柱溫30 ℃；體積流量1 mL/min；進樣體積5 μL；流動相為乙腈-0.2%甲酸水溶液，梯度洗脫程序：0～20 min，20%～40%乙腈；20～30 min，40%乙腈。混合對照品及黃芪樣品HPLC 色譜圖見圖2。

圖2 混合對照品 (a) 和黃芪樣品 (b) 的HPLC-DAD 圖Fig.2 HPLC-DAD of mixed reference substances (a) and Astragali Radix sample (b)

2.3.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷對照品10.11、4.98、3.30 mg，分別溶解于至10、5、10 mL量瓶中并用色譜甲醇定容至刻度，制成質量濃度分別為1.011、0.996、0.330 mg/mL 的對照品溶液。分別吸取上述對照品溶液0.08、0.07、0.15 mL 至10 mL 量瓶中并用色譜甲醇定容至刻度，搖勻，制成混合對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取黃芪樣品粉末約2 g，精密稱定，置100 mL 圓底燒瓶中，精密加入甲醇40 mL，加熱回流1 h，抽濾，濾渣加40 mL 甲醇回流提取1 h，合并2 次所得濾液，于旋轉蒸發儀減壓濃縮并用色譜甲醇定容至5 mL，0.45 μm 微孔濾膜濾過，備用。

2.3.4 線性關系考察 分別取“2.3.2”項下的各對照品溶液，體積為0.05、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液于2 mL 量瓶中并用色譜純甲醇定容至刻度；體積為0.03、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL 的毛蕊異黃酮對照品溶液于2 mL 量瓶中并用色譜純甲醇定容至刻度；體積為0.1、0.3、0.7、0.9、1.3、1.7 mL 的芒柄花苷對照品溶液于2 mL 量瓶中并用色譜純甲醇定容至刻度。按照“2.3.1”項下的色譜條件進行檢測，進樣量5 μL。以峰面積為縱坐標（Y），進樣量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，計算回歸方程結果分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷Y＝19 079X－26.369，R2＝0.999 7，線性范圍25.28～303.30 μg/mL；毛蕊異黃酮Y＝26 723X－38.364，R2＝0.999 7，線性范圍14.94～149.40 mg/mL；芒柄花苷Y＝14 485X－12.39，R2＝0.999 8，線性范圍16.50～280.50 mg/mL；結果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷在相應濃度間線性關系良好。

2.3.5 方法學考察 按照《中國藥典》2020年版[1]方法對實驗進行方法學考察，得到毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷的穩定性的RSD 值在0.97%～1.13%，重復性的RSD 值在1.15%～2.38%，精密度的RSD 值在0.97%～2.16%，平均加樣回收率分別為98.0%、97.0%、97.0%，RSD 分別為0.79%、1.89%、1.15%。

2.4 總多糖含量測定[13]

2.4.1 對照品溶液的制備 精密稱取D-無水葡萄糖對照品0.042 g，加純水定容至100 mL，搖勻，制得含D-無水葡萄糖0.42 mg/mL 的對照品溶液。分別取3、4、5、6、7、8 mL 上述對照品溶液定容至50 mL，得到不同質量濃度的對照品溶液，待測。

2.4.2 供試品溶液的制備 取各樣品粉末約1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水100 mL 回流提取1 h，離心，取沉淀重復上述操作1 次，合并上清液，濃縮至適量，轉移至100 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取5 mL，加乙醇26 mL，渦旋使混勻，離心，取沉淀加水溶解并置于250 mL 量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，待測。

2.4.3 顯色及測定 取不同質量濃度對照品溶液及供試品溶液各2 mL 置于具塞試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，充分混勻，再加入5 mL 濃硫酸，混勻，于40 ℃水浴鍋加熱15 min 后取出，冷卻，采用紫外分光光度計于490 nm 測定吸光度值。

2.4.4 線性關系考察 精密吸取“2.4.1”項下不同濃度的葡萄糖對照品溶液各2 mL 置于具塞試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，充分混勻，再加入5 mL 濃硫酸，混勻，于40 ℃水浴鍋加熱15 min 后取出，水浴冷卻，采用紫外分光光度計于490 nm 處測定吸光度值。以質量濃度為橫坐標（X），吸光度值為縱坐標（Y），繪制D-無水葡萄糖標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程Y＝0.014 8X－0.045 9，R2＝0.999 5，結果表明，D-無水葡萄糖在25.2～67.2μg/mL 與吸光度呈良好的線性關系。

2.4.5 方法學考察 按照《中國藥典》2020年版[1]方法對實驗穩定性、重復性、精密度、加樣回收率進行考察，RSD 分別為2.93%、2.63%、0.94%、1.60%，平均加樣回收率為95.90%。

2.5 總黃酮含量測定

2.5.1 對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷2.50 mg，加70%乙醇定容至100 mL 量瓶中，制成含0.025 mg/mL 毛蕊異黃酮葡糖糖苷的對照品溶液；分別吸取上述對照品溶液1、2、3、4、5 mL 至10 mL 量瓶中并定容至刻度，采用紫外分光光度計于260 nm 下測定吸光度值。

2.5.2 供試品溶液的制備 取黃芪粉末約0.3 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加70%乙醇50 mL，稱定總質量后超聲提取（500 W、50 Hz）30 min，稱定質量，用70%乙醇補足減失質量，抽濾，取續濾液2 mL 定容至10 mL 量瓶中，于260 nm 下測定吸光度值。

2.5.3 線性關系考察 精密吸取“2.5.1”項下不同濃度的對照品溶液，采用紫外分光光度計于260 nm測定吸光度值。以質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（Y），繪制毛蕊異黃酮葡萄糖苷標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程Y＝0.051 3X＋0.031 3，R2＝0.999 8，結果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在2.5～15.0 μg/mL 與吸光度呈良好的線性關系。

2.5.4 方法學考察 按照《中國藥典》2020年版[1]方法對實驗穩定性、重復性、精密度、加樣回收率進行考察，RSD 分別為2.84%、0.95%、0.12%、0.73%，平均加樣回收率為98.1%。

2.6 浸出物含量測定

依據《中國藥典》2020年版第四部水溶性浸出物測定法（通則2201）項下冷浸法測定[1]。

2.7 綜合評分計算[14-15]

熵權法是一種根據多項指標所提供的信息來確定各指標權重的客觀賦權法。信息熵作為體系混亂程度的度量，指標熵值越小，則它所蘊涵的信息量越大，在綜合評價中所起作用也越大，其權重也應越高，具體計算方法如下。

①利用公式（1）進行數據歸一化處理。

②采用公式（2）、（3）定義熵（Ej）。

③利用公式（4）計算指標權重（wj）。

本課題組在前期預試驗中，應用熵權法計算得到黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、總黃酮、總多糖、水溶性浸出物的權重值分別為0.157、0.138、0.234、0.117、0.163、0.121、0.069。綜合評分（Y）＝黃芪甲苷×0.157＋毛蕊異黃酮葡萄糖苷×0.138＋毛蕊異黃酮×0.234＋芒柄花苷×0.117＋總黃酮×0.163＋總多糖×0.121＋水溶性浸出物×0.069，計算不同試驗組別各指標成分綜合評分。

2.8 產地加工炮制一體化工藝優選

2.8.1 模型的建立及顯著性檢驗[16-17]本課題組在前期預試驗中，發現含水量（X1）、發汗時長（X2）、揉搓次數（X3）、干燥溫度（X4）對黃芪產地加工炮制一體化工藝綜合評分影響顯著，故本實驗以X1、X2、X3、X4為考察因素，采用Design Expert 8.0.6 軟件設計4 因素3 水平Box-Behnken 試驗方案。以黃芪甲苷（Y1）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（Y2）、芒柄花苷（Y3）、毛蕊異黃酮（Y4）、總黃酮（Y5）、總多糖（Y6）、水溶性浸出物（Y7）的綜合評分為因變量，采用熵權法綜合評分法優選黃芪產地加工炮制一體化工藝，計算綜合評分（Y）。Y＝Y1w1＋Y2w2＋…＋Y7w7。試驗因素水平、試驗方案與結果見表1。

表1 Box-Behnken 試驗因素與水平和結果與分析Table 1 Factors and levels and results and analysis of Box-Behnken experiments

將各組綜合評分數據采用Design Expert 8.0.6軟件進行多元回歸和二項式分析，建立綜合評分對4 個因素的二次回歸模型方程：Y＝25.50－0.87X1＋0.61X2－0.30X3＋1.71X4＋0.75X1X2－1.70X1X3＋0.34X1X4＋0.20X2X3－0.22X2X4＋0.03X3X4－2.53X12－0.39X22－1.16X32－4.43X42對回歸模型進行方差分析，結果見表2。

表2 響應面試驗結果方差分析Table 2 Variance analysis of response surface experiments results

模型F＝50.57，P＜0.000 1，失擬項P＞0.05 不顯著，表明該模型具有較高的可靠性；此外，該模型調整決定系數R2adj＝0.961 2，表明黃芪產地加工炮制一體化工藝熵權綜合評分96.12%來源于含水量、發汗時長、揉搓次數及干燥溫度；同時，此模型信噪比＝24.953＞4，也進一步表該模型具有一定可靠性。經F檢驗法分析，P值越小，則相應變量顯著性程度越高，本實驗中1 次項X1、X2、X4，二次項X12、X32、X42，含水量和揉搓次數的交互項（X1X3）對黃芪產地加工炮制一體化工藝影響極顯著（P＜0.01），含水量和發汗時長的交互項（X1X2）對黃芪產地加工炮制一體化工藝影響顯著（P＜0.05），其他影響不顯著。

因此，各因素與黃芪產地加工炮制一體化工藝熵權綜合評分之間并非簡單的線性關系，各因素之間存在顯著的交互作用，因此，采用簡單的分析方法難準確分析，而響應面法能夠直觀地了解各因素及相互之間的關系，并能較好地優化黃芪產地加工炮制一體化工藝。

2.8.2 響應面交互作用分析與優化[18-19]根據回歸方程所繪制出各因素交互作用的響應面圖，等高線圖是其投影圖，等高線圖的形狀能夠反映交互作用的強弱，其中，橢圓表示2 因素交互作用較強，而圓形則表示交互作用較弱；同時，響應面的陡峭程度能夠反映出交互作用的強弱。在圖3-A、B 中，等高線圖趨向橢圓，說明含水量與發汗時長和揉搓次數間的交互作用明顯，而其他各因素等高線圖未趨向橢圓，說明其余各因素之間交互作用不明顯。此外，通過對比圖中響應面圖曲面坡度可知實驗中各因素對黃芪產地炮制加工一體化工藝綜合評分的影響大小順序為X4＞X1＞X2＞X3。應用軟件預測最佳加工工藝為含水量49.76%、發汗時長2.69 d、揉搓次數1.97 次、干燥溫度50.87 ℃，綜合評分為25.882 分。

圖3 各因素交互作用對黃芪產地炮制加工一體化工藝綜合評分的響應面和等高線Fig.3 Response surface and contour line of comprehensive score of integrated processing technology of Astragali Radix from different factors interaction

2.9 模型驗證試驗

為便于實際操作將最佳加工工藝參數調整為含水量50%、發汗時長3 d、揉搓次數2 次、干燥溫度51 ℃，據此條件進行3 次驗證試驗，結果見表3，平均綜合評分為25.176，與模型預測值25.882 的偏差為2.727%，說明該優化加工工藝穩定、重復性好、可操作性強。

表3 Box-Behnken 響應面優化法的驗證 (n=3)Table 3 Validation of the Box-Behnken response surface optimization method (n=3)

2.10 趁鮮切制工藝與傳統工藝比較

為進一步對比本實驗優化所得工藝與傳統工藝，故將傳統加工飲片與趁鮮切制飲片進行含量測定。通過綜合評分后，本實驗優化所得黃芪藥材趁鮮切制加工工藝得分25.18，傳統加工工藝所得黃芪飲片綜合得分19.59 分。結果表明本實驗優化所得工藝與傳統相比，趁鮮切制綜合評分高于傳統組，可見黃芪趁鮮切制飲片能有效避免化學成分的損失，保證飲片質量。

3 討論

黃芪藥材產地加工在其品質形成過程中發揮重要作用，就目前有關黃芪藥材產地加工過程而言，其生產者和經營者對其常用加工方法參差不齊，從而導致黃芪飲片及其相關制劑質不一。其次，黃芪藥材在產地加工過程中多以大小、斷面、顏色及氣味等為指標對其質量進行評價，但以上指標多易受主觀因素影響。因此，將其作為主要指標對黃芪產地加工工藝優選及質量評價具有一定缺陷。

中藥化學成分復雜，通過檢測其中某一種活性成分均不能全面反映其質量及整體療效[20]，《中國藥典》2020年版以黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷為指標評價黃芪飲片質量，對黃芪飲片質量控制具重要意義，但黃芪除含有黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷外，還含有黃芪多糖、毛蕊異黃酮等多種成分，這些成分在增強免疫、抗腫瘤、抗氧化過程中發揮重要作用。因此，單以黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷為指標來評價黃芪藥材質量并不全面。而本研究在《中國藥典》2020年版規定的指標性成分基礎上，將黃芪總多糖、總黃酮、毛蕊異黃酮、芒柄花苷納入考察指標，利用響應面法結合熵權法對黃芪產地加工與炮制一體化工藝進行優化，利用數學模型對黃芪質量進行綜合評價，排除了主觀賦權所帶來的誤差，使得評價更為科學合理。

本實驗在前期單因素實驗中，確定了影響黃芪藥材產地加工炮制一體化工藝因素的中心點，其中黃芪藥材含水量為50%，發汗時長為2 d，揉搓次數為2 次，干燥溫度為50 ℃。在此基礎上，通過Design Expert 8.0.6 軟件分析，得到擬合度好，極顯著的多項二次回歸模型。通過分析方差和響應面結果，表明所優選工藝方法可靠、準確性好。最終得到黃芪藥材產地加工一體化最佳工藝為含水量為50%，發汗時長3 d，揉搓次數2 次，干燥溫度為51 ℃，其過程在最大程度上對黃芪藥材產地加工工藝進行簡化，與傳統加工方式相比較，此過程省去藥材干燥及悶潤過程，省時省力，降低黃芪藥材在悶潤及二次干燥過程中有效成分的流失，提高了黃芪飲片質量；同時，此工藝減少黃芪藥材中間貯藏環節，避免在貯藏過程中發生蟲蛀、霉變等問題的出現。

為驗證工藝的可靠性，本實驗按最佳加工工藝做3 組重復試驗，其結果與模型預測值的偏差為2.727%，證明了本實驗優化所得黃芪藥材產地加工與炮制一體化工藝的可靠性。同時，本實驗將優化所得最佳加工工藝與傳統加工工藝進行對比，結果表明趁鮮切制加工工藝所得黃芪飲片質量要高于傳統加工工藝所得黃芪飲片質量，進一步證明了該工藝較傳統加工方式具有一定優勢。

本研究優選的黃芪產地加工炮制一體化工藝簡單、可靠，對黃芪藥材產地加工炮制一體化具有一定指導意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突