豬肉中沙門(mén)氏菌的分離鑒定及PCR快速檢測(cè)分析

崔 霞

（常州市武進(jìn)區(qū)疾病預(yù)防控制中心，江蘇常州 213100）

近年來(lái)，沙門(mén)氏菌造成食物中毒的事件頻繁出現(xiàn)。動(dòng)物性食品是沙門(mén)氏菌重點(diǎn)污染的對(duì)象，動(dòng)物的貯藏、運(yùn)輸、銷(xiāo)售、屠宰加工等步驟都易被沙門(mén)氏菌污染[1]。豬肉是我國(guó)居民的核心肉類(lèi)食品之一，對(duì)沙門(mén)氏菌在豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中的實(shí)際污染以及傳播情況進(jìn)行及時(shí)監(jiān)測(cè)，有利于進(jìn)一步保證豬肉安全。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

豬肉，隨機(jī)選擇3個(gè)超市以及6個(gè)市場(chǎng)。三塘鐵（TSI）瓊脂、HE瓊脂、MH肉湯（MHB）、尿素瓊脂、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、糖發(fā)酵管、TT、MH瓊脂（MHA）、BPW、Taq酶、瓊脂糖、dNTP、溴化 乙 錠（EB）、MgCl2、DNA Marker DL2000、10×Buffer。

1.1.2 儀器與設(shè)備

YM75高壓蒸汽滅菌鍋；IKAT25數(shù)顯型分散機(jī)；Heraeus Muhifuge X3R高速冷凍離心機(jī)；SPX-250-Ⅲ生化培養(yǎng)箱；BIO-RAD凝膠成像分析儀；Mixone漩渦振蕩器；QS-DX7實(shí)時(shí)熒光定量PCR；微量注射器、BY-C18臺(tái)式離心機(jī)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 沙門(mén)氏菌在豬肉中的分離、鑒定

（1）樣品采集。使用無(wú)菌手術(shù)刀取豬腿肉250 g，將其放進(jìn)滅菌容器、保溫箱內(nèi)，第一時(shí)間帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢驗(yàn)。

（2）沙門(mén)氏菌的分離和鑒定。對(duì)PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的肉樣開(kāi)展沙門(mén)氏菌的鑒定和分離[2]，參考相關(guān)方法實(shí)施操作。采取接種環(huán)取1環(huán)TTB增菌液，劃線(xiàn)接種在BS、HE瓊脂平板上對(duì)沙門(mén)氏菌進(jìn)行分離。接著采用賴(lài)氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基、尿素瓊脂以及三糖鐵瓊脂、氰化鉀培養(yǎng)基、糖發(fā)酵管等來(lái)鑒定沙門(mén)氏菌。

1.2.2 豬肉中沙門(mén)氏菌的PCR檢測(cè)

（1）特異性與廣譜性檢驗(yàn)。在LB液體培養(yǎng)基中接種不同的沙門(mén)氏菌以及其他非沙門(mén)氏菌菌株，在175 r/min、37 ℃條件下開(kāi)展純菌培養(yǎng)24 h，提取DNA模板實(shí)施PCR擴(kuò)增，采用電泳法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)[3]。

（2）實(shí)用性檢驗(yàn)。依次培養(yǎng)沙門(mén)氏菌菌株以及志賀氏菌、大腸桿菌等其他菌株，接著將它們混合取100 μL對(duì)1份25 g|無(wú)菌豬肉樣品進(jìn)行感染[4]。把感染之后的樣品在適宜溫度下放置2～5 h后，用225 mL生理鹽水進(jìn)行浸泡，在45 mL LB液體培養(yǎng)基中添加5 mL浸泡液，在37 ℃下培養(yǎng)5 h，取1 mL培養(yǎng)物用來(lái)進(jìn)一步提取DNA模板開(kāi)展PCR擴(kuò)增，采用電泳法對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門(mén)氏菌在豬肉中的分離、鑒定結(jié)果分析

從市場(chǎng)以及超市一共采集83份豬肉樣品，其中超市、市場(chǎng)分別為14份、69份。肉樣里面的熱鮮肉以及冷卻肉分別為39份、44份。

從豬肉樣品中一共分離到21株沙門(mén)氏菌，沙門(mén)氏菌的檢出率達(dá)到了25.3%。超市、市場(chǎng)中冷卻肉的沙門(mén)氏菌檢出率是14.3%、13.3%，兩者之間沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。冷卻肉、熱鮮肉的沙門(mén)氏菌檢出率是13.6%、38.5%，兩者之間差異顯著（P＜0.05）。超市、市場(chǎng)中肉樣的沙門(mén)氏菌檢出率是14.3%、27.5%，兩者之間沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 豬肉中沙門(mén)氏菌的PCR檢測(cè)

2.2.1 特異性與廣譜性

本試驗(yàn)共檢測(cè)了8種不同的沙門(mén)氏菌以及非沙門(mén)氏菌，擴(kuò)增結(jié)果如圖1、2所示。8種不同的沙門(mén)氏菌都可以擴(kuò)增出如圖1中的特異性條帶，片段長(zhǎng)度擴(kuò)增到516 bp，與目標(biāo)片段長(zhǎng)度相同；圖2中沒(méi)有產(chǎn)生條帶的泳道是非沙門(mén)氏菌，實(shí)驗(yàn)里面用的陰溝桿菌、金色葡萄球菌、志賀氏菌、檸檬酸桿菌以及大腸桿菌不能被這一引物擴(kuò)增。結(jié)果表明，這類(lèi)引物不僅具有一定的廣譜性，可以用于擴(kuò)增各種沙門(mén)氏菌，而且這類(lèi)引物的特異性非常高，無(wú)法擴(kuò)增非沙門(mén)氏菌。

圖1 沙門(mén)氏菌PCR擴(kuò)增電泳圖

圖2 沙門(mén)氏菌和其他菌PCR擴(kuò)增電泳圖

2.2.2 實(shí)用性

用沙門(mén)氏菌與其他混菌、單菌對(duì)豬肉樣品進(jìn)行感染，經(jīng)短期培養(yǎng)之后，提取DNA開(kāi)展PCR擴(kuò)增，其結(jié)果充分表明，經(jīng)沙門(mén)氏菌陽(yáng)性感染的樣品都可以擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，而陰性感染的樣品不能擴(kuò)增出條帶，如圖3。

圖3 混合培養(yǎng)物PCR擴(kuò)增電泳圖

在細(xì)菌濃度很高的情況下，全部的沙門(mén)氏菌陽(yáng)性樣品都可以擴(kuò)增出特異性條帶，混合培養(yǎng)物感染與純菌感染的結(jié)果相同。當(dāng)細(xì)菌的濃度達(dá)到了103cfu/mL的時(shí)候，純菌感染樣品的陽(yáng)性檢出率比混合感染樣品高。其核心原因是混合感染樣品經(jīng)過(guò)增菌后，沙門(mén)氏菌以及非沙門(mén)氏菌共同增長(zhǎng)，在整個(gè)細(xì)菌濃度中非沙門(mén)氏菌占了較大的比例，而沙門(mén)氏菌的濃度可能低于103cfu/mL，進(jìn)而導(dǎo)致最終獲取的有效模板濃度太低，乃至PCR反應(yīng)體系不能擴(kuò)增出條帶[6]。另外，盡管常規(guī)PCR對(duì)模板的相關(guān)要求不高，可模板品質(zhì)的好壞也是PCR反應(yīng)是否順利開(kāi)展的一個(gè)核心因素。太多的非目標(biāo)模板DNA也許會(huì)影響引物對(duì)模板DNA的準(zhǔn)確識(shí)別，使擴(kuò)增效率不斷降低。

3 討論與結(jié)論

在豬肉中沙門(mén)氏菌的分離、鑒定實(shí)驗(yàn)中，重點(diǎn)檢測(cè)了沙門(mén)氏菌在豬肉中的實(shí)際檢出情況，結(jié)果表明，本地區(qū)豬肉的微生物污染很?chē)?yán)重，沙門(mén)氏菌檢出率非常高；此外冷卻肉的品質(zhì)優(yōu)于熱鮮肉，集貿(mào)與超市出售的肉的品質(zhì)沒(méi)有太大差異。

本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有對(duì)沙門(mén)氏菌開(kāi)展耐藥基因的檢測(cè)與血清型的鑒定。血清型的相關(guān)鑒定能夠?qū)⑽廴驹达@示出來(lái)，部分血清型與環(huán)境、特定的產(chǎn)品有關(guān)，利用血清學(xué)的相關(guān)知識(shí)可以追蹤流行病，明確食物中毒事件的具體污染源。耐藥基因的相關(guān)檢測(cè)有利于為耐藥性的出現(xiàn)以及傳播提供有效、真實(shí)的信息。于是為了更好地評(píng)估耐藥沙門(mén)氏菌在肉類(lèi)食品中的實(shí)際風(fēng)險(xiǎn)，還需要深入研究分離菌株的耐藥基因檢測(cè)與血清型鑒定。

在豬肉中沙門(mén)氏菌的PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)豬肉樣品與混合培養(yǎng)物中提取的DNA模板實(shí)施了擴(kuò)增，并且獲取了不錯(cuò)的成效。因?yàn)镈NA模板的用量較小，細(xì)菌培養(yǎng)物的濃度太低的時(shí)候，會(huì)使得DNA模板濃度太低，進(jìn)而無(wú)法檢測(cè)出特異目標(biāo)條帶。唯有簡(jiǎn)化操作步驟、減少PCR檢測(cè)成本，PCR檢測(cè)技術(shù)才可以在現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中獲得有效的應(yīng)用。