應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR方法鑒別風(fēng)干牛肉中的成分

龐 婕，胥小榮，孔慶巖，王艷英，趙 冉，牛春玲

（1.承德市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河北承德 067000；2.天津壹鳴環(huán)境科技股份有限公司，天津 300000）

我國(guó)經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展和人們物質(zhì)消費(fèi)水平的不斷提高促進(jìn)了休閑食品的發(fā)展，既美味又方便攜帶的風(fēng)干牛肉逐漸受到眾多年輕人的喜愛(ài)。但肉干零食的成本高，其中動(dòng)物產(chǎn)品摻假是一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題，一些商家為賺取利潤(rùn)，常使用便宜劣質(zhì)的馬肉、豬肉、鴨肉、雞肉甚至鼠肉來(lái)代替高品質(zhì)牛羊肉，如歐洲出現(xiàn)的馬肉和一些以禽肉代替牛羊肉的摻假案例[1-2]。這不僅侵犯了消費(fèi)者的合法權(quán)益，也嚴(yán)重?cái)_亂了市場(chǎng)秩序。實(shí)時(shí)熒光PCR自建立以來(lái)，在食品檢驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用，推動(dòng)了食品就摻假檢驗(yàn)的研究發(fā)展。采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)肉制品中的動(dòng)物源性成分已經(jīng)得到了較多的關(guān)注和研究[3]。

隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，肉類摻假檢驗(yàn)技術(shù)經(jīng)歷了從宏觀到微觀、從組織形態(tài)鑒別到分子水平檢測(cè)的發(fā)展過(guò)程[4]。目前，有關(guān)肉類摻假鑒別的方法主要有如下幾類：基于肉質(zhì)形態(tài)的感官鑒定技術(shù)、基于抗原抗體的酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）技術(shù)、基于核酸的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain reaction，PCR）技術(shù)、基于蛋白質(zhì)組學(xué)的生物質(zhì)譜技術(shù)等[5]。其中PCR技術(shù)適用于多物種鑒定，并且具有高效、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，在傳統(tǒng)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是一種高特異性、高靈敏度的半定量分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

40份風(fēng)干牛肉，來(lái)自10家不同的承德本地風(fēng)干牛肉生產(chǎn)企業(yè)；動(dòng)物組織基因DNA提取試劑盒、馬源性成分核算檢測(cè)試劑盒（PCR熒光探針?lè)ǎ⑴Ｔ葱猿煞趾怂銠z測(cè)試劑盒（PCR熒光探針?lè)ǎ㈦u源性成分核算檢測(cè)試劑盒（PCR熒光探針?lè)ǎ?、鴨源性成分核算檢測(cè)試劑盒（PCR熒光探針?lè)ǎ?，均?gòu)于廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BIO-RAD（CFX96）實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR儀；Ohaus（FC5714）離心機(jī)；雷磁（HY-2）渦旋混勻儀；榮冠（HH）數(shù)顯恒溫水浴鍋；SC1100ⅡB2-X生物安全柜（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

（1）樣品制備。在樣品粉碎區(qū)進(jìn)行，采樣過(guò)程應(yīng)快速完成，取樣應(yīng)同批多點(diǎn)采取肌肉組織，樣品均質(zhì)后取0.1 g放入研缽中，加入液氮，待樣品冷凍完全后快速、用力研磨至粉末狀，研磨時(shí)應(yīng)間斷加入液氮以防止材料融化。

（2）在樣品中加入裂解液（Buffer MTL）和蛋白酶，使其裂解消化，使DNA釋放到裂解液中。然后加入Buffer AL和乙醇。轉(zhuǎn)移至DNA吸附柱子中進(jìn)行過(guò)濾。通過(guò)離心，使DNA被吸附上柱子的膜上，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)則隨溶液濾除。加入Buffer GW1洗去柱子中殘留的蛋白和其他雜質(zhì)，加入Buffer GW2洗去柱子中的鹽分，最后用低鹽緩沖液（Buffer AE）洗脫DNA，洗脫的DNA可直接用于動(dòng)物源性成分的檢測(cè)。

（3）添加模板。剪下所需測(cè)試數(shù)的已含有反應(yīng)液的PCR管，放置在室溫待解凍后，離心30 s后揭開(kāi)封口膜，向每管反應(yīng)液中分別加入5 μL模板，順序?yàn)榭瞻?、陰性?duì)照、待測(cè)樣品模板、陽(yáng)性對(duì)照。蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30 s，離心1 min，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

（4）擴(kuò)增反應(yīng)。使用熒光定量PCR儀，熒光基團(tuán)選擇FAM，淬滅基團(tuán)NONE。

按照下列條件設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)：37℃，10 min；95 ℃，5 min；95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，40 個(gè)循環(huán)。

1.4 結(jié)果判定

①檢測(cè)樣品Ct≥18.52，曲線為直線或輕微斜線，無(wú)“S”型擴(kuò)增曲線，樣品陰性，不含牛源性成分。②檢測(cè)樣品Ct≤18.52，曲線為“S”型擴(kuò)增曲線，樣品陽(yáng)性，含有牛源性成分。③檢測(cè)樣品18.52＜Ct＜40.0，需進(jìn)行一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

為確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)，設(shè)立空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系，在檢驗(yàn)區(qū)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線Ct值判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

分別對(duì)40份風(fēng)干牛肉的DNA進(jìn)行提取和擴(kuò)增。主要針對(duì)牛肉中的成分進(jìn)行分析，通過(guò)實(shí)驗(yàn)顯示，目前市場(chǎng)上牛肉產(chǎn)品質(zhì)量存在一定問(wèn)題，用其他肉制產(chǎn)品充當(dāng)牛肉產(chǎn)品的現(xiàn)象存在，牛源性成分、馬源性成分、鴨源性成分、雞源性成分檢測(cè)結(jié)果的實(shí)時(shí)熒光PCR曲線見(jiàn)圖1至圖4。

圖1 牛源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR曲線

圖2 馬源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR曲線

圖3 鴨源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR曲線

圖4 雞源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR曲線

本次抽取的風(fēng)干牛肉的檢測(cè)結(jié)果如下：共40份樣品，檢出牛源性成分20批，總檢出率為50%；馬源性成分檢出13批，檢出率為32%；鴨源性成分7批，檢出率為18%；雞源性成分未檢出，檢出率為0%。

表1 風(fēng)干牛肉的檢測(cè)情況

3 結(jié)論與討論

食品安全質(zhì)量問(wèn)題關(guān)系民生問(wèn)題，是不容忽視的重要問(wèn)題，市場(chǎng)監(jiān)督管理部門(mén)嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)。檢驗(yàn)部門(mén)作為技術(shù)支撐，提升技術(shù)水平，采用快速、高效的檢驗(yàn)方法，為監(jiān)管保駕護(hù)航。牛肉制品及其相關(guān)產(chǎn)品隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人們生活水平提高，尤其旅游產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，已成為餐桌和出行的必備產(chǎn)品。由此可見(jiàn)，對(duì)其產(chǎn)品的質(zhì)量真?zhèn)蔚谋O(jiān)督勢(shì)在必行。

由于PCR技術(shù)具有簡(jiǎn)便易行、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食品中的定性檢測(cè)。雖然實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)應(yīng)用于肉類摻假鑒別彌補(bǔ)了傳統(tǒng)PCR技術(shù)的不足，但仍存在一些問(wèn)題，PCR技術(shù)對(duì)樣本制備要求較高，且易受到DNA降解、復(fù)雜基質(zhì)干擾等因素影響。不過(guò)該方法依然為食品檢測(cè)尤其是摻假檢測(cè)提供了新思路，可進(jìn)一步監(jiān)管肉類摻假問(wèn)題，維持正常的市場(chǎng)秩序，為市場(chǎng)監(jiān)管提供了技術(shù)保障。