慢性乙型肝炎病毒感染患者HBV DNA載量與IP-10蛋白及IL-12水平相關性分析

張秀麗 丁崗強 張守瑞

（1.浚縣人民醫院感染疾病科，河南 浚縣 456250；2.河南省人民醫院感染性疾病科，河南 鄭州 450003；3.鶴壁市人民醫院腦卒中中心，河南 鶴壁 458030）

目前臨床上多采用患者肝纖維化程度來判斷患者乙型肝炎病情程度，但在乙型肝炎早期臨床上尚未出現肝纖維化，進而缺少早期病情診斷方法。HBV 感染后，不同感染者臨床轉歸差異性大，多數感染者可以憑借自身免疫功能將體內 HBV清除，從而恢復健康。因此，免疫功能在患者臨床轉歸中發揮重要作用[1]。

多種細胞因子，例如白細胞介素-12（Interleukin-12，IL-12）是一種典型的促炎因子，可以參與Th1 細胞免疫應答，同時誘導多種炎性因子產生，進而損傷肝細胞；干擾素誘導蛋白10（Interferon-inducible protein-10，IP-10）是一種趨化因子，研究顯示其在部分慢性HBV 感染患者中表達較高[2]。本文通過分析IL-12、IP-10 蛋白水平與慢性乙型肝炎病毒感染患者HBV DNA 載量的相關性，旨在尋找慢性乙型肝炎病情評估的特異性指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2018 年6 月至2020 年6 月期間收治的135 例慢性乙型病毒性肝炎感染患者，男 75例，女60 例；年齡18～60 歲，平均年齡46.78±8.44歲；體質量指數20～25 kg·m-2，平均體質量指數（24.15±0.67）kg·m-2。吸煙：79 例，總膽固醇4.43±1.07 mmol·L-1

納入標準：均符合慢性乙型肝炎診斷標準[3]；2 w 內并未接受治療；經患者及患者家屬同意并經醫院倫理委員批準。排除標準：合并有其他肝炎病毒感染；患有嚴重自身免疫性肝病；合并惡性腫瘤或肝腎良性腫瘤。

1.2 方法

1.2.1 HBV DNA 載量測定

于入組時采取患者外周血，以3000 rpm·min-1離心10 min 后，取血清標本100 μL 經蛋白酶K消化，70℃ 45 min、95℃ 10 min 裂解DNA 后進行高速離心，取上清備檢。PCR 反應總體積25 μL，包括反應緩沖液2.5 μL、TaqDNA 酶（復旦大學遺傳所）1 μL、dNTP（華美生物工程公司）各0.2 mM、待檢樣品5 μL，剩余體積以無菌雙蒸水補足。分別以94℃、50℃、70℃循環35 周期。產物分析取10 μL PCR 產物在含0.5 μg·mL-1溴乙淀的2%瓊脂糖中電泳30 min，通過PCR 全自動分析儀對熒光進行采集和定量分析。

根據HBV 基因保守序列設計引物（416 bp），上游引物：5'-CCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAG-3'（nt56-83）；下游引物：5'-AAGCCCCAACCAGTGGGGGTTGCGTCA-3'（nt1188-1214），由上海申友公司合成。

1.2.2 IP-10 及IL-12 水平測定

采集患者清晨空腹靜脈血5 mL，在低溫下經3000 r·min-1離心15min 后分離血清，采用酶聯免疫吸附法檢測IP-10 及IL-12 水平。

1.2.3 相關性分析

經多元線性回歸分析不同HBV DNA 載量與IP-10 蛋白及IL-12 水平間相關性。

1.3 統計學方法

將所有數據采用SPSS26.0 進行數據分析，符合正態分布的計量資料以（）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料以例數或百分比表示，采用χ2檢驗；多元線性回歸分析HBV DNA 載量與IP-10 蛋白及IL-12 水平間相關性。以P＜0.05代表差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫炎性因子水平

經熒光定量PCR 法檢測135 例慢性乙型病毒性肝炎感染患者入組時 HBV DNA 載量（486.25±541.21）×105copy·mL-1；經酶聯免疫吸附法檢測IP-10 蛋白（106.69±29.70）pg·mL-1、IL-12（59.61±33.39）pg·mL-1。

2.2 HBV DNA 載量與IP-10 蛋白及IL-12 水平間相關性

經多元線性回歸分析后，IP-10 蛋白及IL-12水平均是慢性乙型肝炎病毒感染患者的影響因素，IP-10 蛋白及IL-12 水平均與HBV DNA 載量呈現正相關（P＜0.05），見表1 及圖1。

圖1 IP-10 蛋白及IL-12 水平與HBV 載量相關性回歸曲線P-P 圖

表1 HBV DNA 載量與IP-10 蛋白及IL-12 水平間的多元線性回歸分析

3 討論

慢性乙型肝炎病毒感染在全世界范圍內具有較高的發病率，給患者、家庭、社會帶來嚴重不良影響[4]。乙肝病毒進入人體后，通過在體內不斷復制，經單核細胞、巨噬細胞吞噬、加工遞進而刺激機體免疫應答，進而引發肝組織的免疫性病理損傷[5]。其中，約有50%左右的HBV 感染患者具有活躍的病毒復制和肝臟的慢性炎癥改變[6]。引發其慢性炎癥改變的原因，大概與以下幾個機制有關[7]：①在免疫、抗病毒治療壓力以及乙肝病毒自然復制逆轉錄過程中出現的乙肝病毒基因突變，逃逸出機體免疫系統的清除效應；同時乙肝病毒的低復制能力尚不能將其有效清除；②HBVDNA 與肝細胞DNA 發生整合，引發肝細胞內轉錄模板的建立，可以長期維持慢性乙肝病毒感染。同時乙肝病毒在免疫細胞中復制可以抑制免疫細胞活性，進而長時間作用于患者機體清除能力，患者本身免疫力低下也是誘發慢性乙肝肝炎病毒感染的重要原因之一。慢性乙型肝炎病毒感染的持續性發展，會加重患者機體肝臟損傷程度，引發肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌的發生，進而降低患者生存質量，縮短生存時間。所以采取及時有效的治療對慢性乙型肝炎病毒感染患者具有重要意義。但是早期慢性乙型肝炎病毒感染患者臨床癥狀不明顯，故臨床開始探究不同免疫炎性因子對慢性乙型肝炎病毒感染患者的影響，以此來判斷其病情的發展。

干擾素誘導蛋白10屬于趨化因子CXC家族，可以通過激活機體免疫系統抵抗病毒抑制病毒復制。研究顯示，Th1 炎性反應是HBV 干擾過程中發揮主要作用的免疫機制，而IP-10 是參與Th1炎性反應的重要趨化因子，可以通過刺激淋巴細胞釋放炎性因子，并增強血管內皮細胞的黏附作用，促進更多炎性因子返巢，同時炎性因子可以刺激IP-10 水平增加，進一步促進淋巴細胞聚集，最終參與機體肝細胞免疫應答的過程，加重慢性乙型肝炎病毒感染的發展[8]。白細胞介素12 是是由抗原呈細胞以及B 細胞產生的，是一種異源二聚體形式的前炎癥細胞因子，可以刺激T 細胞的分化和增值，同時可以促進對Th1 型細胞分化抑制，加重白細胞介素12 的調節紊亂，進而引發慢性乙型肝炎病毒感染的發展[9]。

本研究中，HBV DNA 載量與IP-10 蛋白及IL-12 水平間的多元線性回歸分析顯示，IP-10 蛋白及IL-12 水平與慢性乙型肝炎病毒感染患者HBV DNA 載量呈正相關。

綜上所述，慢性乙型肝炎病毒感染患者HBV DNA 載量與IP-10 蛋白及IL-12 水平呈現正相關，可以作為臨床判斷慢性乙型肝炎病毒感染病情發展的診斷因素。本研究還存在納入病例少、時間短等局限性問題，還需后期大量實驗研究證明。