BC@Laccase消減材料優化制備及其去除水體中2-氯苯酚性能評價

陳 杰 楊 云 胡雪怡 張 勇 龔 宇

（1.上海策安能源科技有限公司，上海，201822；2.浙江理工大學材料科學與工程學院，浙江杭州，310018；3.生態環境部核與輻射安全中心，北京，100082）

隨著我國工業經濟的快速、穩健發展，由此引發的環境污染問題也伴隨產生；其中，由工業廢水超標排放引起的水環境污染尤為突出。制漿造紙工業是工業廢水產生與排放大戶，廢水排放量占我國工業廢水排放總量的20%～30%[1]。紙漿漂白是造紙廢水的主要產生工段，是制漿造紙工業水污染控制的關鍵環節。

含氯漂白是我國制漿造紙工業在紙漿漂白工段應用最廣泛的工藝過程，具有低價高效、技術成熟等優勢[2]。在傳統氯漂過程中，紙漿中木素被氯氣、次氯酸鹽等含氯漂劑碎解、溶出，具有苯環結構的酚類木素碎片在漂白廢水中與殘余氯元素結合[3]，易生成氯酚類持久性有機污染物（Persistent Organic Pollutants，簡稱POPs），具有高毒性、持久性、生物積累性、遠距離遷移性[4]等特點，對人體健康和生態環境造成危害。2-氯苯酚是其中重要的一類POPs 污染物[5]，已被我國列為POPs中優先控制污染物。

漆酶（Laccase）是一種多組分氧化酶，能氧化酚類、氯酚類、芳香胺類及一些無機化合物[6]，其在處理水體污染物中表現出操作簡單、催化效率高且無二次污染等顯著優點[7]，可作為綠色催化劑用于水處理[8]、染料脫色[9]和土壤生物修復[10]等方面。但是，游離形式的漆酶存在較多局限性，如穩定性差、重復利用率低、運行成本高[11]等。為了克服這些缺點，可采用固定化技術，通過固定酶提高漆酶的穩定性和重復利用率，降低處理成本。

細菌纖維素（BC）是由特定細菌產生的一種獨特形式的纖維素，具有良好的機械性能、超細微的三維網狀結構和優異的吸水能力[12-13]，可考慮將其作為固定漆酶的載體。同時，介體能夠有效提高漆酶的催化效率。這類介體易得失電子，迅速被漆酶氧化成活性高且穩定的中間體，作用于底物使其被催化氧化[14]。

為此，基于2-氯苯酚的環境危害、漆酶的催化優勢以及BC 的載體特性，本研究以2-氯苯酚模擬水體中的POPs 污染物，以芥子酸作為漆酶介體，通過酶固定化技術將漆酶固定于BC，優化制備經BC 固定漆酶的BC@Laccase 消減材料，評價BC@Laccase 消減材料對水體中2-氯苯酚的降解和消除能力。

1 實 驗

1.1主要試劑

醋酸桿菌CGMCC 1.1812 購自中國普通微生物菌種保藏管理中心；葡萄糖（AR）、酵母浸粉（UP）、檸檬酸鈉（純度98%）、硫酸鎂（AR）、醋酸鈉（AR）、冰乙酸（AR）、戊二醛（AR）、2-氯苯酚（AR）、4-氨基安替比林（98%）、氯化銨（AR）、芥子酸（純度98%）均購自上海阿拉丁化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀（AR）購自上海三鷹化學試劑有限公司；蛋白胨（BR）、磷酸氫二鈉（AR）、氫氧化鈉（AR）、乙酸鈉（AR）、氨水（AR）、2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS，純度98%）、鐵氰化鉀（AR）均購自上海麥克林生化科技有限公司；漆酶（PP）購自盈芯生物科技（上海）有限公司。

1.2實驗儀器

Nicolet 5700 傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR），美國Thermo Scientific 公司；F1-TGA 209-Libra 熱重分析儀（TGA），德國Netzsch 公司；S-4800 場發射掃描電子顯微鏡（FESEM），日本Hitachi 公司；雷磁pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3BC基材培養

將醋酸桿菌置于種子培養基（30 g/L葡萄糖、6 g/L酵母浸粉、10 g/L蛋白胨、1 g/L檸檬酸鈉、2 g/L硫酸鎂）中，在28℃下，以140 r/min 轉速攪拌動態培養36 h；按10%接種量轉接至發酵培養基（30 g/L 葡萄糖、12 g/L酵母浸粉、12 g/L蛋白胨、2 g/L檸檬酸鈉、2 g/L 硫酸鎂、2.7 g/L 磷酸氫二鈉、2 g/L 磷酸二氫鉀），28℃靜態培養7 天。上述種子培養基和發酵培養基置于高壓滅菌鍋中120℃滅菌20 min，經冷卻后使用。

將發酵培養基表面懸浮BC 膜取出，清水緩慢沖洗，去除膜表面菌體及殘留培養基成分；置于0.1 mol/L氫氧化鈉溶液中，70℃水浴至BC 膜呈白色半透明狀取出；去離子水沖洗后置于1%乙酸中浸泡10 min，用去離子水反復沖洗至中性；將其置于超低溫冰箱中預冷凍4 h，放入冷凍干燥機中冷凍48 h，得到BC 干膜，即固定漆酶用BC基材。

1.4BC@Laccase消減材料優化制備

將10 mg BC 基材浸入2 mL質量分數2.5%戊二醛溶液中，攪拌1 h 使其充分反應；將其置于10 mL 漆酶溶液（0.5 mg/mL）中，一定溫度下溫育20 min；于4℃靜置吸附一段時間。研究固定時間、固定溫度及環境pH 對制備的BC@ Laccase 消減材料酶活的影響。

1.5BC@Laccase消減材料分析表征

1.5.1表觀形貌分析

將BC基材和BC@Laccase 消減材料置于導電膠上鍍金，工作電壓3 kV，通過FESEM 觀察BC 基材及BC@Laccase消減材料的表觀形貌。

1.5.2紅外光譜分析

采用FT-IR 分析BC 基材和BC@Laccase 消減材料的化學結構，掃描范圍500～4000 cm-1，分辨率4 cm-1。

1.5.3熱穩定性分析

采用TG 分析游離漆酶及BC@Laccase 消減材料的熱穩定性，在N2氣氛保護下以10℃/min 升溫速率從常溫升至600℃。

1.6BC@Laccase消減材料降解性能評價

將BC@Laccase消減材料置于2-氯苯酚溶液（10 mL、50 mg/L）中，在200 r/min轉速下攪拌降解一段時間，通過改變介體用量、降解溫度、pH 值及降解時間確定最優的降解工藝及效果。采用4-氨基安替比林法，于最大吸收波長510 nm 處測定2-氯苯酚的吸光度，經換算計算其降解率。

2 結果與討論

2.1BC@Laccase消減材料優化制備

2.1.1固定時間

固定時間對制備的BC@Laccase 消減材料酶活的影響，結果如圖1(a)所示。由圖1(a)可知，12 h 內，游離Laccase 相對酶活保持穩定。BC@Laccase 消減材料的相對酶活隨著固定時間的增加呈現出先升高后下降的趨勢，固定時間在6 h 內，相對酶活較高，在82%以上；當固定時間超過6 h，相對酶活開始持續下降；可能是因為隨著固定時間的延長，BC 基材上的吸附位點逐漸被占據，相關位阻和擴散限制導致其相對酶活降低。

2.1.2固定溫度

固定溫度對制備的BC@Laccase 消減材料酶活的影響如圖1(b)所示。由圖1(b)可知，隨著固定溫度不斷上升，游離Laccase 和BC@Laccase 消減材料的相對酶活均呈現出先升高后下降的趨勢；在25℃達到最大值98.3%，表現出最佳固定效果。當固定溫度低于25℃，游離Laccase 活性受到抑制，相對酶活較低；當固定溫度高于25℃，由于Laccase 氨基酸可能發生特異性突變，導致游離Laccase 失活量增加，相對酶活降低[15]。同時，發現由于游離Laccase 被固定后其空間結構發生變化，溫度對BC@Laccase 活性的影響小于游離Laccase。

圖1 固定工藝條件對BC@Laccase消減材料酶活的影響Fig.1 Influence of immobilizing conditions on enzyme activity of BC@Laccase

2.1.3環境pH值

圖1(c)為環境pH 值對BC@Laccase 消減材料酶活的影響。由圖1(c)可知，在pH 值3.5時，BC@Laccase消減材料相對酶活達到最大值98.5%，表現出最佳固定效果。隨著環境pH 值繼續增大，相對酶活快速下降，這可能與Laccase 周圍支撐微環境和載體表面產生的質子有關[16]。而由于BC 基材孔道內部的微環境與外界環境存在的一定差異，固定化可對孔道內pH起到一定的緩沖作用，因此BC@Laccase 比游離Laccase的pH穩定性更強。

綜上所述，BC@Laccase 消減材料最佳制備工藝條件為：固定時間4 h，固定溫度25℃，環境pH值3.5。

2.2BC@Laccase消減材料分析表征

2.2.1表觀形貌觀察

通過FESEM 對BC 基材和BC@Laccase 消減材料的表觀形貌進行觀察，見圖2。由圖2(a)可以看出，BC 基材表面纖維相互纏結形成精細的網狀結構，纖維絲層層交織形成三維網絡，纖維之間存在大量空隙，允許納米物質進入。這一結構特點使其具有較高的比表面積和良好的透氣、透濕性，適宜作為Laccase 固定載體。在圖2(b)中，由于Laccase 尺寸較小，BC@Laccase 消減材料的大部分Laccase 粒子可以吸附在BC表面或貫穿于基材網絡中。由于BC基材的納米結構具有非常精細和相互連通的纖維網絡，Laccase能在其上均勻分布，較適宜作為Laccase 的固定基材。

圖2 BC基材和BC@Laccase消減材料的FESEM圖Fig.2 FESEM images of BC substrate and BC@Laccase

2.2.2FT-IR分析

BC 基材和BC@Laccase 消減材料的FT-IR 如圖3所示。從圖3 可以看出，對于BC 基材，3403 cm-1和2899 cm-1處存在O—H 和C—H 拉伸振動，1651 cm-1處出現特征峰，代表纖維素的葡萄糖羰基(C—O)[17]。對于BC@Laccase 消減材料，在1420 cm-1和1363 cm-1處出現了2 個重要的特征峰，分別代表C—H 的對稱變形和彎曲振動[18]；1057 cm-1處是葡萄糖環中的骨架—C—O—C—特征峰，897 cm-1處是纖維素骨架中的β-1,4-糖苷鍵；1668 cm-1處出現的酰胺鍵是蛋白質的特征結構，表明Laccase已被成功固定在BC基材上。

圖3 BC基材、游離Laccase和BC@Laccase消減材料的FT-IR譜圖Fig.3 FT-IR spectra of BC substrate,free Laccase and BC@Laccase

2.2.3熱穩定性分析

圖4 為游離Laccase 和BC@Laccase 消減材料的TGA 圖。由圖4 可以看出，在100℃之前，游離Laccase 最先開始分解，主要是其本身含有的水分先流失。游離Laccase 和BC@Laccase 消減材料主要在250～400℃范圍內進行熱分解；游離Laccase 的開始分解溫度為250℃，BC@Laccase 消減材料開始分解溫度為300℃；游離Laccase 的最大熱降解溫度在330℃，BC@Laccase 消減材料的最大熱降解溫度在380℃。這是因為分解溫度低于250℃時，主要是纖維素分子內的結晶區受到破環，使其先分解；分解溫度高于250℃時，主要是酰胺鍵在一定程度上增加其穩定性，使其分解溫度增高，表明BC@Laccase 消減材料熱穩定性明顯高于游離Laccase。

圖4 游離Laccase和BC@Laccase消減材料的TGA圖Fig.4 TGA curves of free Laccase and BC@Laccase

2.3酶學特性分析

米氏常數（Km）是酶的動力學參數，等于酶促反應最大反應速度1/2 時的酶濃度。Km值可反映酶與底物的親和力大小，Km值越小，酶與底物的親和力越大。在底物濃度0.2～1 mmol/L ABTS 溶液中，將適量游離Laccase 和BC@Laccase 消減材料分別與ABTS 溶液反應5 min，420 nm 處測定吸光度變化值，計算酶促反應的初速度V，由Lineweaver-Burk 雙倒數處理，結果如圖5 所示。由圖5 得出，游離LaccaseKm值為1.018 mmol/L，BC@Laccase 消 減 材 料Km值 為1.086 mmol/L。Laccase 被固定后Km值增大，Laccase 與BC基材間的親和力降低，這主要是由于Laccase 被固定后空間位阻增大，BC 基材與Laccase 活性中心的接觸機率變小所致。

圖5 游離Laccase和BC@Laccase消減材料的Lineweaver-Burk雙倒數圖Fig.5 Lineweaver-Burk double reciprocal graph of free Laccase and BC@Laccase

2.4降解2-氯苯酚性能評價

2.4.1介體用量

選定芥子酸作為BC@Laccase 消減材料的催化介體，在降解溫度30℃、pH值6、降解時間4 h條件下，研究芥子酸用量對BC@Laccase 消減材料催化降解水體中2-氯苯酚（10 mL、50 mg/L）降解性能的影響，如圖6(a)所示。由圖6(a)可知，BC@Laccase 消減材料催化降解2-氯苯酚性能隨芥子酸用量的增加呈先升高后降低趨勢。當芥子酸用量在4 mmol/L時達到最佳降解效果，2-氯苯酚降解率達66.3%。

2.4.2降解溫度

在芥子酸用量4 mmol/L、pH 值6、降解時間4 h的條件下，研究降解溫度對BC@Laccase 消減材料催化降解水體中2-氯苯酚（10 mL、50 mg/L）降解的影響，結果如圖6(b)所示。當降解溫度為25～30℃時，BC@Laccase 消減材料對2-氯苯酚的降解率呈上升趨勢；當降解溫度為30～45℃時，降解率開始逐漸下降；降解溫度為30℃時，2-氯苯酚降解率最高達到76.4%。此外，BC@Laccase 消減材料在25～45℃的較寬溫度范圍內對2-氯苯酚的降解率均在73.0%以上，主要是由于Laccase 被固定后其空間結構發生變化，降解溫度對固定Laccase催化性能的影響變弱。

2.4.3環境pH值

在芥子酸用量4 mmol/L、降解溫度30℃、降解時間4 h 條件下，研究環境pH 值對BC@Laccase 消減材料催化降解水體中2-氯苯酚（10 mL、50 mg/L）降解率的影響，如圖6(c)所示。由圖6(c)可知，當pH 值＜3時，BC@Laccase 消減材料的降解性能逐漸增強；當pH 值＞3 時，降解能力迅速降低；當pH 值=3 時，BC@Laccase 消減材料對催化降解2-氯苯酚效果最佳，降解率達到63.3%。

圖6 降解條件對BC@Laccase消減材料催化降解水體中2-氯苯酚性能的影響Fig.6 Effect of degradation conditions on the catalytic degradation of 2-chlorophenol in water by BC@Laccase materials

2.4.4降解時間

在芥子酸用量4 mmol/L、降解溫度30℃、pH 值3的條件下，研究降解時間對BC@Laccase 消減材料催化降解水體中2-氯苯酚（10 mL、50 mg/L）降解率的影響，如圖6(d)所示。由圖6(d)可知，當降解時間為1～5 h 時，BC@Laccase 消減材料對2-氯苯酚的降解能力逐漸增強；當降解時間為5～6 h 時，降解性能出現急劇下降，這可能是由于固定Laccase 在對2-氯苯酚降解過程中底物濃度的減少導致，降解產物的累積也會抑制2-氯苯酚的催化降解。當降解時間為5 h 時，BC@Laccase 消減材料對2-氯苯酚降解性能最佳，降解率為76.9%。

2.5循環使用性能

取10 mg BC@Laccase 消減材料在芥子酸用量4 mmol/L、降解溫度30℃、pH 值3、降解時間5 h 的條件下，催化降解2-氯苯酚溶液（10 mL、50 mg/L），測定其溶液吸光度。使用BC@Laccase 消減材料后，通過緩沖溶液多次沖洗，重復上述操作，BC@Laccase消減材料循環使用對2-氯苯酚溶液降解率的影響如圖7 所示。由圖7 可知，經過7 次循環操作，BC@Laccase 消減材料對2-氯苯酚的催化降解能力仍可保持在最初的84.8%以上，降解率仍保持在65.0%以上，表現出較好的循環使用性能。

圖7 BC@Laccase消減材料催化降解2-氯苯酚的循環使用性能Fig.7 Recycling performance of BC@Laccase on catalytic degradation of 2-chlorophenol

3 結論

以超細微三維網狀結構細菌纖維素（BC）作為固定漆酶（Laccase）支架，通過戊二醛交聯將漆酶固定于BC 基材上，制備環境友好、安全高效的BC@Laccase 消減材料，應用于水體中2-氯苯酚的催化降解。

3.1經過單因素優化得到BC@Laccase 消減材料的最佳制備工藝條件為：固定時間4 h、固定溫度25℃、環境pH 值3.5；與游離漆酶相比，BC@Laccase 消減材料在較寬的溫度和pH 值范圍內可保持較高酶活，具有良好的穩定性。

3.2場發射掃描電子顯微鏡表明，漆酶吸附于BC基材表面并貫穿于其內部網絡，BC@Laccase 消減材料的FT-IR 譜圖出現新酰胺鍵特征峰，表明漆酶與BC基材主要通過酰胺鍵結合并固定。

3.3游離漆酶的米氏常數（Km）值為1.018 mmol/L，BC@Laccase 消減材料Km值為1.086 mmol/L，較游離漆酶有所增大，漆酶與BC基材間的親和力降低。

3.4當芥子酸用量4 mmol/L、降解溫度30℃、環境pH值3、降解時間5 h時，BC@Laccase 消減材料催化降解水體中2-氯苯酚能力最強，降解率達到76.9%。

3.5經過7 次循環使用后，BC@Laccase 消減材料對2-氯苯酚的催化降解能力仍可保持在最初的84.8%以上，表明BC@Laccase 消減材料具有較好循環使用性能。