外周血輔助性T細胞9細胞因子與過敏性鼻炎患者疾病嚴重程度的相關性▲

何 瑋 胡 敏 梁興明 趙世杰 唐 軍 楊強威 林華國 藍 英 陳 龍

(廣西南寧市第二人民醫院耳鼻咽喉科，南寧市 530031，電子郵箱：a15677005435@sina.com)

過敏性鼻炎主要是由IgE介導組胺釋放，并由多種細胞因子和免疫活性細胞參與的鼻黏膜炎性疾病，是一種臨床較為常見的呼吸道過敏性疾病[1-2]。流行病學調查顯示，我國過敏性鼻炎發病率一直居高不下，并且呈現逐年上升的趨勢，其在青少年群體以及過敏體質群體發病率較高[3]。過敏性鼻炎的主要臨床表現為鼻癢、鼻塞、噴嚏、清水樣鼻涕，對患者的生活質量以及身體健康均造成嚴重的影響，但是目前過敏性鼻炎的發病機制尚未完全明確，因此，研究過敏性鼻炎的發病機制對患者的治療具有重要意義[4]。本研究探討輔助性T[淋巴]細胞(helper T cell，Th)-9細胞因子與過敏性鼻炎患者疾病嚴重程度的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年8月至2018年12月在我院門診接受治療的100例過敏性鼻炎患者。納入標準：所有患者均符合中華醫學會制定的過敏性鼻炎診斷標準[5]。排除標準：病歷資料不全患者；呼吸系統惡性腫瘤患者；心、腎、肺等重要器官衰竭或功能不全的患者；有精神病史的患者。按照患者病情嚴重程度[6]分為輕度組36例、中度組49例、重度組15例。其中輕度組男性23例，女性16例，年齡25～41(33.1±6.3)歲；中度組男性27例，女性22例，年齡26～43(34.5±6.8)歲；重度組男性9例，女性6例，年齡26～42(34.1±6.3)歲。3組患者性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有患者及家屬均對本研究知情并簽署知情通知書，本研究已通過我院醫學倫理委員會認可[倫申批號：(2020)倫審第(53)號]。

1.2 方法

1.2.1 標本采集：抽取所有患者治療前清晨空腹手臂內側靜脈血3 mL，使用枸櫞酸鈉進行抗凝處理，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單核細胞，并分兩管收集，分別用于流式細胞術以及實時熒光定量PCR分析。另抽取所有患者治療前清晨空腹手臂內側靜脈血5 mL，以3 000 r/min離心20 min后分離上層血清，在-70℃環境中保存待檢。

1.2.2 Th9細胞比例的檢測：將待測標本傳代至孔板中，并在37℃、5%CO2的環境中進行培養2 h，加入0.25%胰蛋白酶消化，以2 000 r/min離心5 min后使用磷酸緩沖鹽溶液清洗2次，共清洗3 min，再次以2 000 r/min離心5 min后收取細胞，加入1 mL碘化丙啶染液，在避光的常溫環境中放置1 h，使用磷酸緩沖鹽溶液進行洗滌5 min后在各管中加入150 μL固定劑，再加入0.5 mL磷酸緩沖鹽溶液混合均勻制備為懸液，使用流式細胞儀[貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司，型號：CytoFLEX]檢測Th9細胞比例。

1.2.3 轉錄因子PU.1及干擾素調節因子4 mRNA相對表達水平的檢測：采用實時熒光定量PCR技術檢測血漿轉錄因子PU.1及干擾素調節因子4(interferon regulatory factor 4，IRF4) mRNA相對表達水平，嚴格按照定量PCR儀(西安歐拓機電設備有限公司，型號：QTOWER2.2)的操作說明書進行檢測。反應體系：稀釋10倍的PCR緩沖液2.5 μL，氯化鎂溶液1.5 μL，上游引物和下游引物各0.5 μL，最后加水配成25 μL。反應條件：94℃ 1 min；55℃ 1 min；72℃ 1 min，進行35個循環，72℃延長5 min，最少重復3次，以內參U6為參照，采用2-△△Ct方法計算PU.1 mRNA及IRF4 mRNA的相對表達水平。

1.2.4 白細胞介素9、白細胞介素4、轉化生長因子β1水平的檢測：使用酶聯免疫吸附實驗法檢測血清白細胞介素(interleukin，IL)-9、IL-4及轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)水平，檢測過程嚴格按照酶聯免疫吸附實驗試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司，批次：20170201)說明書進行。

1.2.5 癥狀與生活質量進行評價：(1)入院次日，使用鼻結膜炎生存質量調查問卷(Rhinoconjunctivitis Quality of Life Questionnaire，RQLQ)評分[7]對所有患者的癥狀與生活質量進行評價，評價內容包括7個方面，共28個小項，分別為：(1)鼻部癥狀：鼻塞、鼻涕、噴嚏和涕倒流；(2)眼部癥狀：眼癢、流淚、眼痛和眼腫；(3)非鼻眼部癥狀：工作效率下降、注意力難以集中、精力不足、疲倦、疲憊不堪、口渴和頭痛；(4)行為問題：需攜帶面巾紙、需揉鼻或眼和需反復吸鼻；(5)睡眠：入睡困難、夜間醒來次數和睡眠質量不高；(6)日常活動：根據列表中選擇3項日?；顒樱?7)情感反應：沮喪感、無耐心或煩躁、易怒和因癥狀而感到尷尬。每個單項最高分為6分，得分越高說明疾病對患者造成的困擾越嚴重。(2)入院次日，使用視覺模擬量表(Visual Analogue Scale，VAS)評分[8]評價患者鼻部癥狀嚴重程度：在紙上劃出10 cm長的直線，按毫米劃格，一端為無痛，另一端為極痛。患者目測后根據自身情況以直線上無痛端為起點，用筆劃出與其疼痛強度相符合的某點，測量點在直線上與無痛端的距離，重復2次，取平均值。按患者劃出直線長短評價疼痛程度，其中0～2 cm為無痛，3～5 cm為輕度疼痛，有輕微疼痛感，6～8 cm為中度疼痛，有明顯疼痛感，8 cm以上為重度疼痛，有劇烈疼痛感。

1.3 統計學分析 采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；使用多因素Logistic回歸分析Th9細胞因子與過敏性鼻炎患者疾病嚴重程度的相關性。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組患者外周血Th9細胞比例的比較 3組患者外周血Th9細胞比例由高到低為重度組>重度組>輕度組(均P<0.05)。見表1。

表1 3組患者外周血Th9細胞比例的比較(x±s，%)

2.2 3組患者血漿PU.1 mRNA、IRF4 mRNA相對表達水平的比較 重度組血漿PU.1 mRNA、IRF4 mRNA的相對表達水平均高于中度組與輕度組，且中度組血漿PU.1 mRNA、IRF4 mRNA的相對表達水平均高于輕度組(均P<0.05)。見表2。

表2 3組患者血漿PU.1 mRNA、IRF4 mRNA相對表達水平的比較(x±s)

2.3 3組患者血清IL-9、IL-4、TGF-β1水平的比較 重度組血清IL-9、IL-4水平、TGF-β1水平均高于中度組與輕度組，且中度組血清IL-9、IL-4、TGF-β1水平均高于輕度組(均P<0.05)。見表3。

表3 3組患者血清IL-9、IL-4、TGF-β1水平的比較(x±s)

2.4 3組患者RQLQ評分及VAS評分的情況 重度組RQLQ量表各項目評分和鼻部VAS評分均高于中度組、輕度組。見表4。

表4 兩組研究對象癥狀及生活質量評分的情況(x±s，分)

2.5 多因素Logistic回歸分析 以[(RQLQ評分+VAS評分)/2]為因變量(>3分賦值為1，≤3分賦值為0)，以PU.1 mRNA相對表達水平、IRF4 mRNA相對表達水平及血清IL-9、IL-4、TGF-β1水平為自變量(非正常水平均賦值為1，正常水平均賦值為0)進行多因素Logistic回歸分析， 結果顯示，血漿PU.1 mRNA相對表達水平、IRF4 mRNA相對表達水平及血清IL-9、IL-4、TGF-β1水平均是過敏性鼻炎嚴重程度的影響因素(均P<0.05)。見表5。

表5 過敏性鼻炎患者疾病嚴重程度多因素Logistic回歸分析

3 討 論

研究表明，Th細胞與過敏性鼻炎的發生發展密切相關，其中Th1細胞、Th2細胞在過敏性鼻炎的發病過程中均起到重要作用，這是由于Th1細胞能夠調節干擾素γ的分泌，介導機體細胞免疫[9]，而Th2細胞能夠調節IL-4、IL-5與IL-13的分泌，從而起到調節機體免疫的作用[10]。盡管Th1/Th2免疫平衡與過敏性鼻炎的發生發展密切相關，但是并不能充分解釋過敏性鼻炎的發病機制。有學者認為，過敏原能夠將CD4+的Th細胞激活并分化成為不同的T細胞亞群，在過敏性鼻炎的發生和發展過程中起到關鍵作用，Th9細胞是近年新發現的一種Th細胞亞群，許多專家學者開始致力于研究Th9細胞與過敏性鼻炎發病的相關性[11]。IL-9主要由Th9細胞分泌產生，Th9細胞及其分泌的IL-9與自身免疫性腦脊髓炎、系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的發生發展密切相關[12]。IL-9能夠激活信號轉導和轉錄激活因子信號通路，促進調節性T細胞以及Th17細胞分泌，若阻斷IL-9信號通路，會使調節性T細胞功能下降[13-14]。本研究結果顯示，隨著過敏性鼻炎患者病情嚴重程度的發展，其Th9細胞比例及血清IL-9水平亦隨之升高，說明Th9細胞比例及血清IL-9水平與過敏性鼻炎的發生發展具有一定的相關性。

PU.1是E26轉錄因子家族的主要成員，是Th9細胞的特異性轉錄因子。有研究顯示，PU.1能夠使Th9細胞表型增強[15]。除PU.1之外，IRF4也是Th9細胞的特異性轉錄因子，在Th9細胞分化以及功能維持方面起到關鍵作用[16]。本研究結果顯示，隨著過敏性鼻炎患者病情嚴重程度的發展，其PU.1 mRNA與IRF4 mRNA相對表達水平亦隨之升高，說明PU.1 mRNA、IRF4 mRNA與過敏性鼻炎的發生發展具有一定的相關性。

IL-4、TGF-β1也是Th9細胞的轉錄因子，與Th9細胞、IL-9水平變化密切相關[17]。研究表明，IL-4在過敏性鼻炎患者血清中呈現異常高表達，其水平變化與過敏性鼻炎的發生發展密切相關[18]。TGF-β1是一種重要的促纖維化生長因子，與過敏性鼻炎的發生發展密切相關[19-20]。本研究結果顯示，隨著過敏性鼻炎患者病情嚴重程度的發展，其血清IL-4、TGF-β1水平亦隨之升高，說明血清IL-4、TGF-β1水平與過敏性鼻炎的發生發展具有一定的相關性。本研究多因素Logistic回歸分析結果顯示，PU.1 mRNA相對表達水平、IRF4 mRNA相對表達水平及血清IL-9、IL-4、TGF-β1水平均是過敏性鼻炎嚴重程度的影響因素(均P<0.05)。

綜上所述，隨著過敏性鼻炎病情嚴重程度的發展，患者Th9細胞比例、PU.1 mRNA相對表達水平、IRF4 mRNA相對表達水平及血清IL-9、IL-4、TGF-β1水平隨之上升，且IL-9、PU.1 mRNA、IRF4 mRNA、IL-4、TGF-β1均是過敏性鼻炎嚴重程度的影響因素。