蜂蜜酒發酵工藝條件的優化研究

董彩文，王明雷，白少怡，胡曉龍，王 悅，黃天琪

（1. 鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002；2. 河南省食品生產與安全協同創新中心，河南 鄭州 450002）

蜂蜜是工蜂采集開花植物的花蜜或蜜露以及自身的分泌物，在蜂巢中經過充分釀造加工得到的純天然物質[1]。蜂蜜酒擁有長久的釀造歷史，既保留了天然蜂蜜的營養成分，同時使重要活性物質如氨基酸、維生素和礦物質的含量增加，因此具有良好的營養功能[2-4]。

麥曲廣泛用于黃酒的釀造過程，并對黃酒的釀造和風味起著重要的作用[5-10]。在蜂蜜酒的釀造過程中，大部分情況下用酵母進行發酵[11-14]，很少使用酒曲，導致蜂蜜酒的風味不足。在蜂蜜酒的發酵過程中使用酒曲和酵母，可以增加蜂蜜酒的風味[15-16]。本實驗把麥曲和酵母一起用于蜂蜜酒的發酵，經過單因素考察了不同因素對酒精生成的影響，然后經過響應面分析得到酒精最高生成值，并進行驗證試驗，進而達到優化發酵工藝的目的。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

棗花蜜：河南省長葛市；麥曲：蘇-16，江蘇省地方特產專營店；酵母：高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；磷酸氫二銨（食品級）：江蘇科倫多食品配料有限公司。

1.2 儀器與設備

FE20 特勒-托利多實驗室pH 計：梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；HH-S2數顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市醫療機械廠；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；TG16-WS 臺式高速離心機：湘儀離心機儀器有限公司；LX-C35L 型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：合肥華泰醫療設備有限公司；電熱恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；UV9100 全自動紫外可見分光光度計：美國Lab Tech 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酒精度的測量

參照標準方法[17]，發酵結束后離心，取上清進行酒精度的測定，并換算成 20 ℃時的酒精度。

1.3.2 發酵溫度對酒精度的影響

取適量蜂蜜和蒸餾水配制糖度為16.0%的蜂蜜液，80.0 ℃水浴20 min，冷卻。在超凈工作臺中將蜂蜜液依次倒入十個錐形瓶中，每瓶250 mL。然后依次加入麥曲10.0 g，酵母0.5 g，搖勻。分別在24.0、26.0、28.0、30.0、32.0 ℃條件下培養3 d。按照1.3.1 的方法進行酒精度的測定。

1.3.3 發酵時間對酒精度的影響

取適量蜂蜜和蒸餾水配制糖度為22.0%的蜂蜜液，80.0 ℃水浴20 min，取出冷卻。在超凈工作臺中將蜂蜜液依次倒入10 個錐形瓶中，每瓶250 mL。然后依次加入麥曲10 .0 g，酵母0.5 g，30.0 ℃培養箱中培養。培養時間分別為3、4、5、6、7 d。按照1.2.1 的方法進行酒精度的測定。

1.3.4 磷酸氫二銨添加量對酒精度的影響

取適量蜂蜜和蒸餾水配制糖度為22.0%的蜂蜜液，80.0 ℃水浴20 min，冷卻。在超凈工作臺中將蜂蜜液依次倒入 10 個錐形瓶中，每瓶250 mL。然后依次分別加入磷酸氫二銨300、600、900、1 200、1 500 mg/L，麥曲10.0 g，酵母0.5 g，30.0 ℃培養箱中培養5 d。按照1.2.1 的方法進行酒精度的測定。

1.3.5 發酵液糖度對酒精度的影響

取適量蜂蜜和蒸餾水配制糖度為 16.0%、20.0%、24.0%、28.0%、32.0%的蜂蜜液，80.0 ℃水浴20 min，取出冷卻。在超凈工作臺中將蜂蜜液依次倒入10 個錐形瓶中，每瓶250 mL。然后依次加入磷酸氫二銨225 mg，麥曲10.0 g，酵母0.5 g，30.0 ℃培養箱中培養5 d。按照1.3.1 的方法進行酒精度的測定。

1.3.6 響應面優化

在分別確定了單因素對蜂蜜發酵過程中酒精度生成的影響后，根據響應面試驗設計原理，選取三個對酒精度生成影響較大的因素，然后在每個因素方向選取三個數值進行響應面分析試驗，如下表。

表1 實驗因素及水平Table 1 Experimental factors and levels

1.4 數據分析

單因素實驗結果用 Microsoft Office Excel 2016 對其進行分析，利用 Design Expert 10 軟件對工藝參數的組合進行優化，利用響應面分析法（RSM）得到回歸模型和工藝參數。試驗數據均采用平行試驗的平均值，并利用SPSS 軟件對數據進行組間方差分析，在 95% 的置信區間內各組之間是否顯著，用相同字母表示不顯著，用不同字母表示顯著。

2 結果與分析

2.1 發酵溫度對酒精生成的影響結果

溫度是發酵過程中酵母參與反應的重要因素之一，發酵溫度對酵母發酵過程中產生的酒精有一定影響[14]。由圖1 看出，當溫度從24 ℃上升到26 ℃時，酒精度隨溫度的升高而明顯上升，并達到最大值，隨后出現波動。方差分析結果表明，24 ℃和26 ℃兩個實驗組在95%水平下差異顯著，26、28、30、32 ℃四個試驗組在95%水平下無顯著性差異。所以初步選定發酵溫度為30 ℃。

圖1 發酵溫度對酒精度的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on alcohol content

2.2 發酵時間對酒精生成的影響結果

發酵時間對酵母發酵過程中產生的酒精也有一定影響[18]，前發酵期發酵作用不強，主發酵期主要進行酒精發酵作用，糖分迅速下降，酒精逐漸增多。后發酵期由于大部分糖分被消耗，產生酒精較少。

圖2 表明，在發酵時間從4～5 d 時，酒精度上升明顯，之后隨發酵時間延長變化不大。方差分析結果顯示，發酵時間3、4 d 兩個實驗組和發酵時間5、6、7 d 三個實驗組在95%水平下差異顯著。發酵時間初步選為5 d。

圖2 發酵時間對酒精度的影響Fig.2 Effect of fermentation time on alcohol content

2.3 磷酸氫二銨添加量對酒精生成的影響結果

發酵液中氮源過多會造成酵母菌生長過快，反而不利于產物的積累。氮源不足又會使菌體生長緩慢，在穩定期引起菌體自溶。因此合理控制氮源的添加量能促進菌體穩定生長以及產物的積累[19]。圖3 表明，磷酸氫二銨濃度的變化對酒精度影響不明顯。方差分析結果顯示，五個實驗組無顯著性差異。說明在這個范圍內磷酸氫二銨的濃度對蜂蜜發酵液酒精度影響不大。所以磷酸氫二銨濃度初步選為900 mg/L。

圖3 磷酸氫二銨添加量對酒精度的影響Fig.3 Effect of diammonium phosphate on alcohol content

2.4 發酵液糖度對酒精生成的影響的結果

當發酵液中糖度過高時，不僅會抑制乙醇產生途徑中乙醇脫氫酶的活性而影響發酵，而且也不利于酒精產物的積累，同時會造成高滲透壓環境而抑制酵母的生長。發酵液糖度過低又會減緩酵母生長，并且糖分幾乎全為酵母生長所用，導致發酵不能正常進行[20]。

圖4 表明，酒精度隨著發酵液糖度升高而上升，當發酵液糖度從20.0%～28.0%時，酒精度上升的趨勢明顯。通過方差分析得知，糖度16.0%、20.0%、24.0%、28.0%四個實驗組在95%水平下差異顯著，糖度28.0%和32.0%兩個實驗組無顯著性差異。初步選定發酵液糖度為28.0%。

圖4 發酵液糖度對酒精度的影響Fig.4 Effect of fermentation liquid sugar on alcohol content

2.5 響應面優化的結果

2.5.1 酒精度回歸模型的建立和顯著性檢驗

由響應面分析得到17 組實驗條件，每組做次平行實驗后得到實驗結果如下表。

經響應面軟件對數據進行擬合，得到回歸方程：

由表3 知，模型的P值<0.00 1，說明了模型的極顯著性。回歸方程方程相關系數R2=0.976>0.9，表明約有97.6%的酒精度變化可由此模型解釋。對糖度、溫度、時間分別進行分析，發現溫度P<0.05，時間P<0.00 1，說明溫度和時間對酒精度的影響分別是顯著和極顯著的。而糖度P值為0.558 7>0.05，說明糖度對酒精度影響不顯著。在二次項中，糖度P<0.01、溫度P<0.01、時間P<0.01，說明提取糖度、溫度和時間對酒精度的影響都是高度顯著的。交互項中AC<0.01，BC<0.01，差異高度顯著。綜上所述，回歸方程給酒精度提供了一個合適的模型。

表3 回歸方程方差分析結果Table 3 Analysis results of regression equation variance

2.5.2 響應面分析結果

響應面的曲面形狀可作為其影響因素顯著水平的依據，曲面的陡峭程度用以表明其顯著性，曲面越陡說明越顯著。由圖5 可看出，相對于溫度和糖度，發酵時間對酒精度影響較為顯著。

圖5 發酵時間、溫度、糖度及交互作用對蜂蜜酒發酵酒精度影響的響應面Fig.5 Response surface of fermentation time, temperature, sugar content and interaction on the fermentation alcohol degree of honey wine

響應面優化分析結果顯示，當發酵液初始糖度為31.0%，發酵溫度為31.6 ℃，培養時間為6 d的時候能夠得到酒精度的理論最大值為13.8%。

2.5.3 驗證實驗

為了驗證該模型給出的方案是否與實際情況相符合，進行兩次平行驗證實驗。出于實際情況的考慮，將理論最優條件圓整為發酵液初始糖度為31.0%，發酵溫度為32.0 ℃，培養時間為6 d。由此得到發酵液酒精度為13.2%，實際測定值與預測值的相對誤差為4.3%，說明響應面模型能較好的反應實際情況。在響應面分析實驗第17 組中，當發酵液糖度為32.0%，發酵溫度為32.0 ℃，培養時間為 6 d 時，得到的發酵液酒精度為13.6%，大于驗證實驗結果。所以，該條件作為最佳條件。該結果與理論的優化結果存在一定的差距，可能是實驗的條件控制等方面的誤差所導致。

3 結論

本研究通過單因素實驗，考察了發酵溫度、發酵時間、磷酸氫二銨添加量、發酵液糖度等因素對酒精度的影響。通過響應面優化得出酒精度的優化結果為：當麥曲添加量10.0 g，酵母添加量0.5 g，磷酸氫二銨添加量150 mg，發酵液糖度為32.0%，pH 值為4.5，發酵溫度為32.0 ℃，培養時間為 6 d 時，能得到酒精度的最高值為13.6%。同時，經過初步感官評價，麥曲和酵母共同發酵的蜂蜜酒的風味明顯優于單獨用酵母發酵的蜂蜜酒。