4株放線菌對柱花草促生作用的測定

楊德友，楊 琳，閆向楠，唐吉雲(yún)，駱焱平，王蘭英

（海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，海口 570228）

柱花草（StylosanthesSw.）又稱巴西苜蓿、熱帶苜蓿等，柱花草是我國熱帶、亞熱帶地區(qū)栽培的主要豆科牧草，具有干物質(zhì)產(chǎn)量高、粗蛋白含量高等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用到反芻動物飼料中[1?3]。中國南方如廣東、廣西等省(區(qū))，將柱花草與果樹間種，柱花草除用作飼草外，還可起到覆蓋、保持水土和綠肥作用[4]。中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院自20世紀(jì)60年代起從國際熱帶農(nóng)業(yè)研究中心(Centro International Agriculture Tropicals, CIAT)等地引進(jìn)柱花草種質(zhì)，先后培育了‘熱研2號’(Stylosanthes guianensis‘Reyan No.2’)、‘熱研5號’(Stylosanthes guianensis‘Reyan No.5’)等優(yōu)良柱花草品種13個[5]。近年來，柱花草的根部和葉部病害日益嚴(yán)重，嚴(yán)重影響了柱花草的產(chǎn)量和品質(zhì)[6?8]，因此，開展柱花草的增產(chǎn)促生作用研究具有一定的實(shí)際意義。

微生物通過調(diào)節(jié)生物地球化學(xué)循環(huán)、有機(jī)質(zhì)重組和礦化的多種酶活性改善土壤條件[9]從而在維持土壤的健康和促進(jìn)健康土壤的形成中發(fā)揮重要作用。近年來，微生物對植物的促生作用逐漸引起科研人員的關(guān)注，正在成為應(yīng)用微生物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。植物根際促生菌(Plant-growth-promoting rhizobacteria，簡稱PGPR)是指能夠促進(jìn)植物生長、增加作物產(chǎn)量、防治病蟲害的有益細(xì)菌。根際促生菌對植物生長促進(jìn)的機(jī)制可分為直接和間接2種方式。直接的促生作用是指PGPR能產(chǎn)生一些生長促進(jìn)物質(zhì)，如生長激素和鐵載體等，供植物利用，促進(jìn)植物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收；間接的促生作用是指PGPR通過對病原微生物的生物防治，減輕或抑制有害微生物，從而間接促進(jìn)植物生長[10?11]。有研究表明，放線菌除具有很好的生防作用外，也能通過產(chǎn)生長素，溶解磷酸鹽，產(chǎn)生鐵載體等方式促進(jìn)植物生長[12?13]。本實(shí)驗室在前期實(shí)驗中分離得到4株對土傳病害具有良好防效的內(nèi)生放線菌NM2、NM3、NM17和NM24。筆者以柱花草為供試植物，采用皿內(nèi)測定法和盆栽實(shí)驗法，研究本實(shí)驗室在前期實(shí)驗中分離得到的4株放線菌對柱花草形態(tài)指標(biāo)和生理生化指標(biāo)的影響，旨在探究4株放線菌對柱花草的促生長作用及柱花草的增產(chǎn)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試菌株供試內(nèi)生放線菌分別為婁徹氏鏈霉菌（Streptomyces roche，代號NM2、NM3）和密旋鏈霉菌（Streptomyces pactum，代號NM17、NM24），由海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥研究室保存并提供。

1.2 制備供試放線菌的孢子懸浮液按照文獻(xiàn)[14]的方法制備高氏1號培養(yǎng)基：可溶性淀粉（20 g），KNO3（1 g），K2HPO4（0.5 g），MgSO4·7H2O（0.5 g），NaCl（0.5 g），F(xiàn)eSO4·7H2O（0.01 g），瓊脂(16 g)，蒸餾水1 L， pH=7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。分別配制4種供試放線菌的孢子懸浮液（109cfu·mL?1），并按10%接種量分別接種在高氏1號培養(yǎng)液中，28 ℃，160 r·min?1振蕩培養(yǎng)5 d。分別取振蕩培養(yǎng)5 d的發(fā)酵液300 mL，經(jīng)8 000 r·min?1離心10 min后，將上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾制得發(fā)酵液原液。將原液用無菌水稀釋成10倍、50倍、100倍的發(fā)酵液，與原液一同備用；

1.3 種子與土壤柱花草種子由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院品質(zhì)資源研究所提供。精選均一且顆粒飽滿無破損的柱花草種子，用1%高錳酸鉀表面消毒，再用無菌水沖洗3次后，用溫燙法催芽直到種子露白（備用）。盆栽所用土壤（采自海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院教學(xué)基地）過篩并進(jìn)行干熱滅菌。

1.4 柱花草皿內(nèi)測定法實(shí)驗皿內(nèi)測定方法在文獻(xiàn)[15]的方法上做一定的修改：取10粒稱質(zhì)量后的露白柱花草種子放入直徑為9 cm鋪有濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，沿培養(yǎng)皿邊緣每天同一時間分別加入3 mL供試菌株，用無菌水稀釋成10倍、100倍的發(fā)酵液，在日夜溫度[（18±2） ℃～（25±2） ℃]下進(jìn)行，每天自然光照為10 h，培養(yǎng)4 d。分別以無菌高氏1號液體培養(yǎng)液和無菌水為對照，每個處理重復(fù)3次。

1.5 盆栽實(shí)驗盆栽實(shí)驗于2019年11?12月在海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院實(shí)驗教學(xué)基地進(jìn)行。溫室條件：28 ℃、濕度70%、自然光照。將催芽露白的柱花草種子均勻放置于裝滿滅菌土壤的盆缽里，再覆蓋1層無菌土。出苗后第5天移植于裝有1 400 g土的培養(yǎng)缽中，每處理30株。每株放線菌對柱花草促生長實(shí)驗設(shè)3個處理，3個處理為分別淋施發(fā)酵液原液、10倍稀釋發(fā)酵液、50倍稀釋發(fā)酵液，對照為分別淋施無菌高氏1號液體培養(yǎng)液和無菌水，實(shí)驗共設(shè)12個處理組，2個對照組，每處理3次重復(fù)。間苗時盡量使各培養(yǎng)缽內(nèi)幼苗間隔一致。從拌土種植后連續(xù)3次每隔7 d澆灌處理液50 mL，以維持和加強(qiáng)放線菌的作用。

1.6 生物性狀測定皿內(nèi)測定法實(shí)驗：待無菌水處理的種子根和莖出現(xiàn)明顯區(qū)分時，測量幼苗培養(yǎng)前后的質(zhì)量，計算凈增重值、莖長、根長。盆栽實(shí)驗：第3次澆灌7 d后取樣，測量形態(tài)指標(biāo)，包括幼苗鮮質(zhì)量、幼苗株高；生理生化指標(biāo)，包括葉綠素總含量[16]、可溶性糖含量（蒽酮法）[17]、可溶性蛋白質(zhì)含量（考馬斯亮藍(lán)法測定）[18]、根系活力強(qiáng)度(TTC法)[19]。

1.7 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)差異性分析，其中使用單因素方差分析法（ANOVA）分析數(shù)據(jù)，并使用LSD進(jìn)行多重比較分析。各項數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean ± SD）表示。采用OriginPro 2018C軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 皿內(nèi)測定法實(shí)驗結(jié)果分析

2.1.1 放線菌對皿內(nèi)柱花草幼苗鮮質(zhì)量和莖長的影響由圖1可見，與無菌水對照組（KQ）和無菌高氏1號液體培養(yǎng)液對照組（KP）相比，4株放線菌發(fā)酵液在不同稀釋濃度下均能促使幼苗鮮質(zhì)量增加和莖的伸長，其中，放線菌NM24的發(fā)酵液在稀釋10倍和稀釋100倍后均可顯著提高幼苗的鮮質(zhì)量；與KP相比，在稀釋10倍條件下，放線菌NM3、NM24、NM17和NM2促進(jìn)莖的伸長百分比依次為48.34%、39.34%、38.01%和37.70%，稀釋100倍條件下則為28.00%、29.60%、34.40%和36.25%；與KQ相比，在稀釋10倍條件下，放線菌NM3、NM24、NM17、NM2促進(jìn)莖的伸長百分比依次為49.56%、40.50%、39.15%和38.84%，稀釋100倍條件下則為32.23%、33.88%、38.84%和40.75%，差異顯著。

圖1 4株放線菌對柱花草幼苗鮮質(zhì)量和莖長的影響Fig. 1 Effect of 4 strains of Streptomyces on the fresh weight and stem length of the Stylosanthes seedlings

2.1.2 放線菌對柱花草幼苗根長的影響由圖2可見，經(jīng)放線菌發(fā)酵液處理后的柱花草幼苗根長的伸長生長與無菌水對照組（KQ）和空白培養(yǎng)液對照組（KP）相比，均受到不同程度的抑制作用，菌株NM2和NM17的抑制隨發(fā)酵液濃度的降低而減弱。

圖2 4株放線菌對皿內(nèi)柱花草幼苗根長的影響Fig. 2 Effect of 4 strains of Streptomyces on root length of theStylosanthes seedlings

2.2 盆栽實(shí)驗結(jié)果分析

2.2.1 放線菌對柱花草株高的影響盆栽實(shí)驗結(jié)果（圖3）表明，經(jīng)放線菌發(fā)酵液處理后的柱花草幼苗株高，與無菌水對照組（KQ）和培養(yǎng)液對照組（KP）相比有所增加。其中，與對照組（KP、KQ）相比，4株放線菌不同濃度的發(fā)酵液對柱花草的促進(jìn)作用均達(dá)到顯著水平，其中，放線菌NM2、NM3和NM17隨發(fā)酵液濃度降低，對柱花草株高的促進(jìn)作用減弱；放線菌NM24對柱花草株高的促進(jìn)作用隨發(fā)酵液濃度降低呈現(xiàn)增加趨勢。

圖3 4株放線菌對皿內(nèi)柱花草幼苗株高的影響Fig. 3 Effect of 4 strains of Streptomyces on the plant height of the Stylosanthes seedlings

2.2.2 放線菌對柱花草鮮質(zhì)量的影響由圖4可見，經(jīng)過放線菌發(fā)酵液處理后的柱花草幼苗鮮質(zhì)量，與無菌水對照組（KQ）和空白培養(yǎng)液對照組（KP）相比有所增加。與無菌水對照組（KQ）相比，4株菌株的發(fā)酵液原液、10倍稀釋發(fā)酵液和50倍稀釋發(fā)酵液處理都顯著增加柱花草幼苗鮮質(zhì)量。其中，在發(fā)酵液原液濃度下，放線菌NM2、NM17、NM24和NM3對柱花草鮮質(zhì)量增加百分比在發(fā)酵液原液濃度下依次為67.53%、64.94%、49.35%和46.75%；在10倍稀釋液條件下依次為64.94%、62.34%、59.74%和46.75%；在50倍稀釋液條件下依次為54.55%、41.56%、62.34%和33.77%。與培養(yǎng)基對照組相比，差異并不顯著，推測可能是培養(yǎng)液中含有一些柱花草生長需要的營養(yǎng)物質(zhì)對柱花草鮮質(zhì)量的變化產(chǎn)生了影響。

圖4 4株放線菌對柱花草幼苗鮮質(zhì)量的影響Fig. 4 Effect of 4 strains of Streptomyces on the plant height of the Stylosanthes seedlings

2.2.3 放線菌對柱花草根系活力和葉綠素含量的影響經(jīng)放線菌發(fā)酵液處理后的柱花草幼苗根系活力和葉綠素含量的測定結(jié)果（圖5）表明，與無菌水對照組（KQ）和空白培養(yǎng)液對照組（KP）相比，4株放線菌發(fā)酵液均顯著提高了柱花草的根系活力（圖5-A），且菌株NM2、NM3和NM17隨發(fā)酵液濃度降低，根系活力呈現(xiàn)減弱的趨勢；在葉綠素含量結(jié)果中（圖5-B），與無菌水對照組（KQ）和空白培養(yǎng)液對照組（KP）相比，4株放線菌發(fā)酵液原液和10倍稀釋液都顯著增加了柱花草的葉綠素含量，且隨著發(fā)酵液濃度降低，增加效果減弱。其中，與KQ相比，放線菌NM17、NM2、NM24和NM3對柱花草葉綠素含量增加百分量在發(fā)酵液原液濃度下依次為27.84%、18.13%、13.19%和11.36%；在10倍稀釋液條件下依次為17.21%、12.64%、7.51%和11.17%；與KP相比，放線菌NM17、NM2、NM24和NM3對柱花草葉綠素含量增加百分量在發(fā)酵液原液濃度下依次為28.33%、18.59%、13.62%和11.79%；在10倍稀釋液條件下依次為17.67%、13.07%、7.93%和11.60%。

圖5 4株放線菌對柱花草幼苗根系活力和葉綠素含量的影響Fig. 5 Effect of 4 strains of Streptomyces on root activity and chlorophyll content of the Stylosanthes seedlings

2.2.4 放線菌對柱花草可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響經(jīng)過放線菌發(fā)酵液處理后柱花草幼苗可溶性蛋白和可溶性糖含量的測定結(jié)果（圖6）表明，與無菌水對照組（KQ）和空白培養(yǎng)液對照組（KP）相比，淋施放線菌不同稀釋濃度的發(fā)酵液均相應(yīng)提高了柱花草的可溶性蛋白含量（圖6-A），其中，與KQ相比，放線菌NM2、NM24、NM17和NM3對柱花草可溶性蛋白含量增加百分量在發(fā)酵液原液條件下依次為36.10%、33.17%、29.36%和27.32%；在10倍稀釋液條件下依次為24.39%、34.63%、26.44%和11.51%；在50倍稀釋液條件下依次為26.15%、15.61%、11.51%和10.63%；與KP相比，放線菌NM17、NM2、NM24和NM3對柱花草可溶性蛋白含量增加百分量在發(fā)酵液原液條件下依次為28.81%、26.04%、22.44%和20.50%；在10倍稀釋液條件下依次為17.73%、27.42%、19.67%和5.54%；在50倍稀釋液條件下依次為19.39%、9.42%、5.54%和4.71%，且菌株NM2、NM3和NM17隨發(fā)酵液濃度降低，可溶性蛋白含量呈現(xiàn)降低的趨勢。可溶性糖含量結(jié)果（圖6-B）表明，與無菌水對照組（KQ）相比，淋施菌株NM2、NM17和NM24發(fā)酵液原液和10倍稀釋液都增加了柱花草的可溶性糖含量，其中，放線菌NM24、NM17和NM2對柱花草可溶性糖含量增加百分量在發(fā)酵液原液條件下依次為33.48%、23.08%和9.80%；在10倍稀釋液條件下依次為22.62%、5.43%和4.52%。隨著發(fā)酵液濃度降低，柱花草可溶性糖含量增加效果減弱，且菌株NM24的促進(jìn)效果與對照相比具有顯著差異，但菌株NM3對柱花草可溶性糖含量的增加則起到抑制作用。隨著發(fā)酵液濃度降低，抑制效果減弱。

圖6 4株放線菌對柱花草幼苗可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響Fig. 6 Effect of 4 strains of Streptomyces on the soluble protein and soluble sugar contents of the Stylosanthes seedlings

3 討 論

關(guān)于放線菌的促生作用已經(jīng)開展了大量的研究，如王艷等[20]的報道表明，內(nèi)生放線菌SR-1102不僅能有效防治蔬菜立枯病，同時能使番茄、辣椒產(chǎn)量分別提高10.10%～14.61%、7.67%～13.53%；據(jù)李興昱等[21]報道，放線菌ZZ-9可通過有效促進(jìn)小麥幼苗的生長來提高小麥植株的抗病性；BAOUNE等[22]分離的17株鏈霉菌屬的內(nèi)生放線菌，均能夠通過產(chǎn)生鐵載體、溶解磷酸鹽、IAA、固氮等方式促進(jìn)植物生長。可見，放線菌不僅可作為重要的生防資源，還對植物表現(xiàn)出良好的促生作用[23]。對放線菌的促生作用主要從對植物的形態(tài)指標(biāo)和生理生化指標(biāo)的影響進(jìn)行評價。植株根長、莖長、株高和鮮質(zhì)量是容易觀察和測定的直觀指標(biāo)，一般作為形態(tài)指標(biāo)測定內(nèi)容。植物中葉綠素含量直接影響光合作用強(qiáng)度，對提高植物的產(chǎn)量有一定意義[24?25]；可溶性蛋白質(zhì)可以反映出植物體的代謝強(qiáng)度，它參與新器官的建成，而且有一部分是直接調(diào)控各種生化反應(yīng)的酶[26]；可溶性糖既是高等植物的主要光合產(chǎn)物，又是碳水化合物代謝和暫時貯藏的主要形式，在植物碳代謝中占有重要位置[27]；根系活力是衡量根系功能的主要指標(biāo)之一，植物根系是植物營養(yǎng)和水分的吸收器官，根的生長情況和活力水平直接影響地上部的生長和營養(yǎng)狀況[28]，上述這些指標(biāo)可以較全面地代表植株的生長健康狀況，一般作為生理生化指標(biāo)測定內(nèi)容。本研究結(jié)果表明，4株放線菌發(fā)酵液在不同稀釋濃度下都促使幼苗鮮質(zhì)量的增加和莖的伸長，并且在高濃度下均能提高柱花草葉綠素、可溶性蛋白質(zhì)的含量。同時除NM3外，其余3株放線菌在高濃度下也能提高柱花草植株可溶性糖的含量。由此可見，供試的放線菌可以顯著地增加柱花草形態(tài)指標(biāo)量的變化，也能在高濃度下顯著地增強(qiáng)柱花草生理生化指標(biāo)質(zhì)的提升，對柱花草具有很好的促生作用，具有提升柱花草產(chǎn)量和品質(zhì)的潛質(zhì)。本研究結(jié)果表明，利用不同放線菌發(fā)酵液對柱花草幼苗進(jìn)行處理，可顯著提高柱花草生理指標(biāo)和增加干物質(zhì)積累量。故推測其增產(chǎn)機(jī)制可能是放線菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物通過直接促生長作用，促進(jìn)柱花草地下部根的伸長，吸收更多的水分和養(yǎng)分，從而增加地上部鮮質(zhì)量，提高幼苗葉綠素含量，促進(jìn)柱花草光合能力增強(qiáng)，進(jìn)而增加干物質(zhì)的積累，最終提高柱花草的品質(zhì)和產(chǎn)量。

另外，本研究結(jié)果還表明，供試的4株放線菌對柱花草不同測定指標(biāo)活性順序不同，如在10倍稀釋液濃度下，4株放線菌對皿內(nèi)幼苗鮮質(zhì)量促進(jìn)作用的大小依次為NM24>NM2>NM3>NM17，對盆栽幼苗鮮質(zhì)量促進(jìn)作用的大小依次為NM2>NM17>NM24>NM3，對葉綠素含量促進(jìn)作用的大小依次為NM17>NM2>NM3>NM24。可見，每種放線菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物明顯存在差異，對不同測定指標(biāo)起作用的活性物質(zhì)也不同。因此，在后續(xù)研究中有必要進(jìn)一步開展放線菌的促生活性成分的研究，以便為放線菌次生代謝產(chǎn)物的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。