伊蚊5-HT受體家族生物信息學分析和時空表達譜的構建

李妙珍，李奕勛，陳 靜，張 磊，廖承紅，韓 謙

（海南大學 生命科學與藥學院/熱帶動物醫學與病媒生物學實驗室，?？?570028）

5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）又稱血清素，是廣泛分布于脊椎動物和無脊椎動物的中樞神經系統和外周神經組織中的一種重要的神經遞質[1]。5-HT通過與5-HT受體（5-hydroxytryptamine receptor，5-HTR）結合調控許多重要的生理和行為過程，如運動[2]、繁殖[3]、性活動、進食[4]、情緒和感情[5]、睡眠[6]、食欲等[7]。5-HT受體分型復雜，至少有7大類14種亞型在人類基因組中被發現，除5-HT3受體是配體門控離子通道外，其余5-HT受體都是G蛋白偶聯受體。根據保守的氨基酸序列和第二信使激活系統，昆蟲的5-HT受體可分為5-HTR1、5-HTR2和5-HTR73種[1]。

5-HT和5-HTR在昆蟲的免疫系統中發揮關鍵的調節作用，研究發現菜青蟲中的（Pieris rapae）5-HTR1B和5-HTR2B能介導5-HT引起的血細胞吞噬作用[8]，該研究在分子水平上證實了昆蟲也與哺乳動物一樣，可以通過5-HT來調節神經系統與免疫系統的相互作用，為利用5-HT類藥物特異性干擾昆蟲免疫系統，增強生物殺蟲劑效力提供了可能性。研究還發現通過激活神經元釋放出的大量的5-HT，會抑制黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）的進食和交配行為[4]。同樣，在蜜蜂（Apis mellifera）大腦中注射5-HT，其進食行為受到抑制，但是在腸道中注射5-HT則會刺激腸道肌肉的收縮[9]。在埃及伊蚊（Aedes aegypti）中，使用CRISPR-Cas9技術敲除5-HTR2B會導致埃及伊蚊的生長抑制，并且減少成蚊的脂質積累[10]。目前，研究人員還對5-HTR1A的激動劑衍生物進行設計、合成和生測，發現其能夠影響昆蟲的生長和幼蟲的活性[11]，此結果更加表明了5-HT受體可作為有害昆蟲的藥物靶標。隨著全球殺蟲劑的濫用，傳統小分子殺蟲劑的耐藥性成為控制節肢動物傳播傳染病的一個難題，需要具有新的作用方式和對抗性害蟲種群活性的殺蟲劑化學制劑作為替代。破壞節肢動物G蛋白偶聯受體（GPCR）靶標的小分子殺蟲劑逐漸成為人們關注的重點，將用于開發下一代殺蟲劑[12?13]。

埃及伊蚊（Aedes aegypti）是基孔肯尼雅熱、黃熱病和登革熱等急性傳染病的主要傳播媒介，每年會造成數億人感染病毒[14]，嚴重威脅人類健康。已有研究報道，埃及伊蚊吸血行為與5-HT的濃度有關[10]。目前，有關埃及伊蚊5-HT受體家族的功能與結構尚未分析透徹。本研究首先對文獻已報道的昆蟲5-HT受體蛋白進行生物信息學分析，然后采用多序列比對和系統進化樹構建法對5-HT受體基因進行進化分析，最后對每個受體進行不同發育時期的表達譜分析，為埃及伊蚊5-HT受體蛋白的功能研究提供基礎，進而為新型殺蟲劑尋找靶標。

1 材料與方法

1.1 蚊蟲來源埃及伊蚊（Rockfeller株）來自軍事科學院軍事醫學研究院微生物流行病研究所。

1.2 埃及伊蚊5-HT受體基因家生物信息學分析通過比對NCBI和VectorBase 2個數據庫序列，獲取埃及伊蚊5-HT受體序列，并下載5-HT受體蛋白的氨基酸序列。利用TMHMM Server v2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）程序在線對蛋白序列進行跨膜結構預測；利用在線工具SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）對埃及伊蚊5-HT受體蛋白的二級結構進行預測；使用Signal P 5.0在線軟件預測埃及伊蚊5-HT受體的信號肽；使用在線軟件Clustal Omega對不同昆蟲的5-HT受體氨基酸序列進行多序列比對，用鄰接法（Neighbor-Joining）對氨基酸序列構建進化樹。Bootstrap設為1 000，其余參數采用默認設置，分析不同昆蟲的5-HT受體的進化關系。

比較Protein Data Base數據庫中已知5-HT受體蛋白的晶體結構，采用GeneDoc計算數據庫序列相似性分析，發現埃及伊蚊5-HTR7B與已知人類5-HTR1B的序列相似性最高，為38.61%。利用SWISSMODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive），以Hsap5-HTR1B蛋白的晶體結構[15]（PDB：V）為模板，構建埃及伊蚊5-HTR7B三級同源模型。

1.3 埃及伊蚊5-HT受體基因家族的表達譜構建（1）埃及伊蚊總RNA的提取。分別收集50只1齡幼蟲，50只2齡幼蟲，30只3齡幼蟲，10只4齡幼蟲，4只白色雌蛹，4只白色雄蛹，4只黑色雌蛹、4只黑色雄蛹，2只雄蚊，2只未吸血的雌蚊，實驗重復3次；解剖20只未吸血雌蚊，分別收集其頭、胸、腹、附肢4個部位，實驗重復3次。采用Trizol法[16]提取埃及伊蚊不同樣品的總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用微量核酸檢測儀檢測RNA濃度和純度。（2）cDNA模板的合成。使用TAKARA逆轉錄試劑盒合成cDNA：gDNA Eraser Buffer 2.0 μL, gDNA Eraser 1.0 μL，Total RNA 1.0 μL，RNase Free dH2O 6.0 μL，混勻后，42 ℃反應2 min，轉移至冰上，再加入PrimeScript RT Enzyme Mix 10.0 μL，RT Primer Mix 1.0 μL，5×PrimeScript Buffer 2 (for Real Time) 4.0 μL，RNase Free dH2O 4.0 μL，混勻，37 ℃反應15 min，85 ℃反應5 s，?20 ℃保存備用。（3）熒光定量PCR檢測不同發育時期和不同組織中的表達量。采用熒光定量試劑盒（ROCHE）對各個基因進行qRT-PCR分析。反應體系為：實時熒光定量PCR預混液5 μL，上、下游引物各0.5 μL（10 μL·mL?1），模板cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL。使用Roche公司的LightCycler96進行實時擴增檢測。反應采用兩步法PCR擴增標準程序：95 ℃ 20 s，95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，共40個循環。以RPS17為內參基因[16]，每個樣品設置3次重復，實驗所用引物見表1。

表1 熒光定量PCR引物Tab. 1 Primers for fluorescence quantitative PCR

1.4 統計學分析根據定量檢測結果，以2?△△Ct法[17]計算樣品間基因表達量的差異倍數，用Graphpad Prism 6.0軟件T檢驗法進行數據的統計分析，用LSD法進行多重比較檢驗，顯著性檢驗水平P< 0.05。

2 結果與分析

2.1 5-HT受體氨基酸序列分析及三級結構建模根據數據庫數據分析，發現埃及伊蚊有5-HTR1A、5-HTR1B、5-HTR1D、5-HTR2B、5-HTR7A、5-HTR7B共3個5-HT受體家族6個亞基，TMHMM數據跨膜螺旋結構分析結果表明，它們均有7個跨膜區，屬于典型的G蛋白偶聯受體；利用SignalP 5.0在線軟件預測埃及伊蚊5-HT受體蛋白的氨基酸序列[18]，發現除5-HTR7B有可能存在SP信號肽外，其他亞基均不存在信號肽。表2結果表明，埃及伊蚊5-HT受體蛋白主要由α螺旋、延伸鏈以及無規則卷曲構成，并且還有少量的β-轉角，其中α螺旋的比例非常高，約占二級結構組成原件的28.09%～47.64%，5-HTR7B的α螺旋比例最高，為 47.64%；5-HTR1D的α螺旋比例最低。每種受體蛋白都含有無規則卷曲，其中5-HTR1A的無規則卷曲比例為49.14%，是6種受體中比例最高的；5-HTR7B的無規則卷曲比例最少。在埃及伊蚊5-HT受體家族的二級結構中，β-轉角的含量相對較少，其中5-HTR1B的β-轉角比例最少，5-HTR1D的β-轉角比例最高，為6.71%。

表2 埃及伊蚊5-HT受體蛋白二級結構的主要元件比例Tab. 2 The proportion of major secondary protein structure of 5-HT receptor protein in A. aegypti.

用Proteindatabase中已知Hsap5-HTR1B（圖1-A）的晶體結構做為模板，根據SWISS-MODEL同源建模軟件構建埃及伊蚊5-HTR7B（圖1-B）的三級結構。其GMQE值為0.4，QMEAN值為?3.93，均在合理范圍之內[19?20]。拉氏圖是用來描述蛋白質結構中氨基酸殘基二面角ψ和φ是否在合理區域的一種可視化方法，可以反映出蛋白質構象是否合理[21]。結果表明，埃及伊蚊5-HTR7B所有氨基酸都存在在綠色和淺綠色的允許區域，無氨基酸在白色不允許區域（圖1-C），證明這些氨基酸殘基具有較好的構象空間[22]。結合GMQE值、QMEAN值和拉氏圖可知，所建模型合理[23?27]。同源建模結果顯示，Aae5-HTR7B具有7個α螺旋，是典型的7次跨膜G蛋白偶聯受體。與Hsap5-HTR1B相比，在α4～α7間的loop差別較大。應用Clustal Omega 軟件[28]對埃及伊蚊5-HT受體基因家族成員完整ORF進行同源性和保守域比對，結果表明，埃及伊蚊5-HT受體基因家族之間相似性較低，其保守域的同源性約為40%（圖2），主要集中在跨膜區。

圖1 埃及伊蚊5-HT受體蛋白的三級結構建模Fig. 1 Tertiary structure modeling of 5-HT receptor protein in A. aegypti

圖2 埃及伊蚊5-HTR家族保守結構域序列比對Fig. 2 Alignment of conserved domains of 5-HT proteins family in A.aegypti

2.2 埃及伊蚊5-HT受體的系統進化分析利用MEGA7的鄰接法對6個受體基因構建系統進化樹（圖3）。高粱蚜蟲（Melanaphis sacchari）作為半翅目昆蟲[29]，與埃及伊蚊親緣關系較遠，因此，可以其作為外群構建系統進化樹。結果表明，該進化樹分為3個分支，Aae5-HTR1D與淡色按蚊的5-HTR1D在同一分支；Aae5-HTR1A與黑腹果蠅5-HTR1A為同一分支，其和致倦庫蚊5-HTR2同源性較高；Aae5-HTR2B從黑腹果蠅5-HTR2B分支上演化而來，并且與Aae5-HTR1D更接近；Aae5-HTR7A、5-HTR7B受體與黑腹果蠅5-HTR7聚類為一支。

圖3 埃及伊蚊5-HT受體蛋白系統進化樹（Boostrap值為1 000）Fig. 3 Phylogenetic tree of 5-HT receptor proteins in A. aegypti

2.3 埃及伊蚊5-HT受體基因發育表達模式5-HT受體基因在各發育時期均有表達，如圖4-A—4-E結果所示，5-HTR1A、5-HTR1B、5-HTR1D、5-HTR2B、5-HTR7A5個受體基因在1齡到4齡幼蟲中表達水平較低，到蛹期有顯著增加（P< 0.05），而5-HTR7B基因在1 ～4齡階段，表達量與蛹期水平相近，隨幼蟲發育到成蟲，表達量逐漸增高（圖4-F）。結果同時表明，顯示6個受體基因的表達在雌雄成體中具有明顯的性別差異，所有的雄性成體的表達量均高于雌性成體（圖5-A—5-F），這與家蠶的表達模式不同[30]。

圖4 埃及伊蚊5-HT受體不同發育時期表達譜Fig. 4 Expression profile of 5-HT receptor in A. aegypti at different developmental stages

2.4 埃及伊蚊5-HT受體基因組織表達模式6個亞基在不同組織中的表達模式差異較大。Aae5-HTR1A在蚊蟲頭部的表達量最高，其次是胸腔，在腹部也有較少的表達量，但其在腿部并無表達（圖5-A）；Aae 5-HTR1B在頭部有較高的表達豐度，但是在胸腔、腹部和附肢中表達量較少（圖5-B）；Aae5-HTR1D在各個組織中的表達量相比于其他受體是最低的，并且它是唯一只在胸腔和腹部表達的5-HT受體，其表達豐度最高的組織是胸腔，在腹部也有較少的表達量（圖5-C）；Aae5-HTR2B在頭、胸、腹和附肢中均存在表達豐度，其中頭部的表達量最高，腹部的表達量最少（圖5-D）；Aae5-HTR7A是唯一在附肢中具有高表達的受體，但其在頭部中沒有表達豐度，在腹部中存在較少的表達（圖5-E）；Aae5-HTR7B與Aae5-HTR2BD的組織表達豐度相似。

圖5 埃及伊蚊5-HT 受體不同組織表達譜Fig. 5 Expression profile of 5-HT receptor in A. aegypti at different tissues

3 討 論

本研究通過生物信息學方法分析了埃及伊蚊5-HT受體的結構，通過同源建模確定5-HT受體具有7個跨膜區，是典型的G蛋白偶聯受體，并且跨膜區結構保守。該結果與果蠅、家蠶等昆蟲的受體家族結構一致[30?31]。

不同的5-HT受體在昆蟲體內分布不同，與5-HT結合在昆蟲體內發揮的生理功能也不同[1]。有研究表明，Dm5-HTR1A、Dm5-HTR2A和Dm5-HTR7在頭部表達，主要參與果蠅的短期學習和記憶[32]；黑腹果蠅Dm5HT1A受體、Dm5HT1B受體和Dm5HT7受體在幼蟲嗅覺選擇行為及食欲和厭惡聯想嗅覺學習和記憶中具調節性[33]。當黑腹果蠅5-HT受體缺失或表達下調的情況下，果蠅由于血細胞吞噬能力的降低從而在被病原菌感染后更容易死亡。本研究發現Aae5-HTR1A、Aae5-HTR1B、Aae5-HTR1D、Aae5-HTR7B在頭部特異性高表達，而蚊蟲頭部具有很多氣味性受體，因此，這4個受體可能與蚊蟲的吸血、交配、尋找宿主等行為有關，但后續仍需對此進行驗證。有研究報道Aae5-HTR2B基因被敲除后埃及伊蚊的生長和繁殖受到影響[10]。本研究還發現Aae5-HTR1D在頭部和四肢中并無表達，但是在胸腔中具有顯著性高表達，暗示其可能與胸腹部消化功能相關。而Aae5-HTR7A在頭部沒有表達，是唯一在四肢中特異性高表達的5-HT受體，蚊蟲附肢中存在豐富的感受器，能感受外界環境的氣味以及環境的溫濕度/鹽度，因此，推測該受體可能參與外界溫濕度或者氣味的感知[34]。通過構建埃及伊蚊5-HT受體基因家族時空表達譜還發現，埃及伊蚊5-HT受體在蚊蟲的各個時期都有表達，說明5-HT受體在埃及伊蚊的整個生活史中均發揮作用，可能是蚊蟲基本生理活動必需的。其中，Aae5-HTR1D、Aae5-HTR1B、Aae5-HTR7A在幼蟲階段的表達較低，但是在蛹期和成蚊期表達量高，暗示這些受體可能主要與蚊蟲的幼蟲后期發育及成體的生理功能有關。

目前研究認為，在昆蟲體內5-HT作為重要的神經遞質，對昆蟲的生長發育以及行為活動等方面都具有許多重要作用，而其發揮作用主要通過分布在體內不同位置的受體介導。因此，通過對埃及伊蚊5-HT受體家族的序列分析和表達譜構建，進而進一步研究其功能，將對探索控制蚊蟲及傳播病原尋找新型藥物提供新的思路。