中藥含藥血清制備的思考與探討

郭迎超 梁爽 周波

摘要：中藥含藥血清作為干預手段在中藥藥理研究體外實驗中越來越受到廣大科研工作者的重視，并取得一定的進展。科學、嚴謹、標準的實驗設計方案貫穿于整個中藥含藥血清制備的全過程，直接影響到血清中藥物有效成分的含量、活性等，對于模擬中藥在體內真實藥理活動過程至關重要，也是中藥及復方體外實驗研究取得成功的關鍵點。基于課題組在進行中藥復方養營活血湯含藥血清制備的過程中，查閱相關文獻及制備方法，對中藥含藥血清制備進行詳細的梳理，并提出一些見解，以饗同道。

關鍵詞：含藥血清;制備方法;研究

中圖分類號：R285.5?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：1007-2349（2021）09-0051-05

中藥含藥血清是指根據實驗設計的需要用中藥（單味或復方）按照一定的劑量、規定的劑型（大多用中藥煎湯）和預定的給藥次數、給藥時間等對特定的動物如大鼠、小鼠、豚鼠和兔等進行灌胃后，選擇適宜的采血法在擬定的時間內采集動物的血液并對其進行分離，最后得到的含有藥物本身、藥物代謝產物、活性成分、雜質成分和一定酸堿度變化等的血清復合物。中藥含藥血清是用于代替原藥物的粗提物作為供試材料進行體外實驗的，其可避免中藥復方粗提物本身的理化性質等對實驗結果的干擾[1]。

1 中藥含藥血清制備的研究現狀

1.1 動物種屬的選擇 中藥含藥血清的制備首先要考慮供體動物的選擇，不同種屬、年齡的動物對藥物吸收也不相同，因而造成血藥成分、濃度的差異[2]。有報道因藥物不同、被采血動物的種屬差異及同一種屬間的個體差別而獲得的含藥血清中各種因子含量也不盡相同，并由此在后續的試驗中可能會影響到細胞貼壁[3]。所以，欲獲得合理可信的實驗結果，必須在一開始就有較為合理的實驗設計。

動物種屬的選擇要求同質性。所謂的同質性即含藥血清的供體動物需要與體外試驗用的離體器官、組織和細胞的供體動物能夠保持統一的標準，只有在標準相同的前提下實驗結果才最有意義。具體表現在選擇動物時應特別強調保證動物的種屬一致、年齡相同、同一性別及體重基本相等等方面，而且，供體動物應該造模，即在相同的生理病理狀態下獲得的含藥血清才最有實驗價值。在目前多數研究中血清供體動物均選用的是正常動物，忽略了血清供體動物造模[4]。因此，上述問題還需進一步深入討論。

最好選擇與人類生物特性相似的動物如正常的小鼠、大鼠和兔等進行實驗研究。

1.2 動物的給藥方案 動物的給藥方案主要包括給藥劑量、給藥次數、給藥時間和給藥途徑等，其中最為重要的是給藥劑量。通常認為中藥含藥血清中血藥濃度的高低是由機體當時的血藥濃度決定的，即含藥血清的濃度（體積比）越高就意味著藥物的效果越明顯，而該血藥濃度與給藥劑量存在一定量效關系，但是，有研究提示動物體內給藥劑量、中藥含藥血清的藥物濃度與藥效強弱三者之間并非呈平行關系[5]。

給藥的方法包括：固定容量給藥法，如制備某含藥血清時按固定容量2 ml/次給藥，即在保持容量不變的基礎上通過調整給動物灌胃的藥物濃度而達到目標劑量;固定藥物質量給藥法，如制備某含藥血清時按固定質量2 g/次給藥;固定藥物容量和質量給藥法，即結合規定容量給藥法又參考規定質量給藥法;按單位體質量藥物給藥量給藥，有報道在復方六月雪含藥血清制備時予以復方六月雪高、中、低劑量組分別是6.6 mg/（kg·d）、3.3 mg/（kg·d）和1.7 mg/（kg·d）給藥[6];按人體等效劑量倍數給藥，如陳彩霞等[7]制備金欣口服液含藥血清時對實驗動物予以金欣口服液36 g/（kg·d）（相當于人臨床等效劑量的4倍）進行灌胃;或按臨床成人用量的倍數給藥，如陸海英等[8]在制備中藥抗纖靈方含藥血清時灌胃量取10倍于人的有效劑量，即每只大鼠每天灌服藥液3ml（含生藥6g）。以上幾種給藥方案一定要結合具體實驗酌情選用，需要注意的是，以200 g左右大鼠為例，考慮到其胃的容積，每次灌胃劑量最好不超過2ml。課題組在制備養營活血湯含藥血清時是按照大鼠與成人的每千克體重等效劑量折算系數6.25換算大鼠用藥劑量灌胃給藥。

1.3 動物的給藥時間 為減輕動物的不適和避免其它因素可能帶來的干擾，建議每次在給動物進行灌胃前先禁食8～12 h，且給藥時間應安排在動物空腹狀態下最為合理。

有人認為，在給動物或人服藥1周甚至10 d 之后所取得的血清，盡管此時已接近或模擬了體內的藥物實際情況，但已不再是藥物本身，因其中的有些活性成分被胃酸滅活、或在肝臟中被滅活，當然無法再認為是該藥物的單純作用了。也有人提出快速給藥、短時間內取血的血清制作方法，可是在實驗中又發現用這種方法所制作的血清藥效較差而導致無法進行后續的實驗。

課題組在制備中藥含藥血清時采用每12 h對大鼠灌胃給藥1次，連續給藥3 d（即共6次），于末次給藥1.5 h后采血。也有其他多種不同的給藥方案，如肖政華等[9]制備扶肝化纖湯含藥血清時采用日1次，連續6 d，第7 d重復給藥2次，間隔時間2 h，于末次給藥后1 h予腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血。

1.4 動物的采血時機 采血時機主要指藥物與動物作用的最佳時間節點，與藥物代謝的時間密切相關，牽涉到藥代和藥動兩方面。理論上講，中藥含藥血清采血時間應落在血藥濃度的高峰期，但因每種藥物達到血藥濃度的高峰期也不盡相同，故在進行具體實驗時，應根據所選藥物的種類、實驗目地和預實驗結果等，結合不同種類藥物的藥物峰值而選擇不同的采血時間[10]。

研究發現在對動物末次給藥后1 h和2 h取血點獲得的血清藥效較強[11]。可見最理想的采血時間應在動物末次給藥后1～2 h之內，課題組制備中藥復方含藥血清時是將采血時間安排在動物末次給藥后的1.5h，應注意的是按每組大鼠末次給藥的先后順序依次進行采血，盡量使每只大鼠末次給藥時間與采血時間均間隔1.5 h，按此法制備的含藥血清在后續的體外實驗中發現藥效良好。

1.5 動物的采血方法 目前常用的動物采血方法及優缺點如下：眼眶靜脈叢采血具有操作簡便、取血量大、血流速度快的優點，缺點是進針深度難以控制且易凝血;割（剪）尾取血損傷小，但取血量少且易感染;心臟采血有定位準確、取血量大、操作簡便的特點，但是應注意麻醉藥深度，不可過量;腹主動脈采血法的優點在于血量大且不易溶血，但操作相對復雜和對技術性要求較高。

1.6 動物含藥血清的過濾及存儲 多數觀點支持對大鼠含藥血清進行過濾除菌。具體做法是將大鼠稱重后，水合氯醛腹腔注射麻醉，在無菌條件下進行腹主動脈取血，靜置1小時后，在4℃、3000 rpm/min離心10 min，取上層血清用0.22 μm濾器過濾后再分裝至1.5 mL凍存管中。

含藥血清的儲存一般分為-20℃和-80℃低溫凍存，依據實驗時間的長短選擇，因過長的儲存時間可能會影響到含藥血清的作用，故建議以短期儲存為好。

2 中藥含藥血清制備存在的問題及思考

目前，盡管中藥含藥血清作為重要的干預手段已廣泛應用于臨床研究中，但是仍存在很多的問題需要我們去進一步探討和完善。

2.1 動物的選擇方案需要標準化 標準化的動物選擇方案對下一步的實驗起決定性作用，只有在統一標準下制備的中藥含藥血清進行體外實驗所獲得的數據才最有說服力。建議在實驗設計的初期選擇動物時應注意：（1）同步化，即各實驗組采用同種正常血清，使細胞在24h或更長的時間內在貼壁率上達到一致。（2）藥物血清實驗組和對照組的血清必須采自同一種屬的同類動物，即年齡和性別相同、體重基本統一等。（3）用于培養細胞與制備含藥血清的動物應保持同一種屬，即人的含藥血清僅能用于人的細胞。

2.2 血清供體動物造模的必要性 近年來科學家們發現即使同一種藥物，其藥代動力學參數可因人群、生理、病理或遺傳背景的不同呈現差異[12]。當前，國內很多研究者在應用中藥含藥血清進行體外實驗時，這些含藥血清大部分來自于正常動物而非造模的動物，嚴格來講，這種實驗設計方案的合理性是需要討論的。韋振源[13]認為，不同個體對同一種藥物的藥代動力學參數在不同生理、病理條件下，由于機體的狀態不同會出現不同的結果，血液中的物質成份也會發生變化，從而對實驗結果造成一定程度的影響，使之不能真實地反映所研究的單味中藥或復方的作用。故建議最好使用病理狀態下制備的含藥血清進行后續的實驗。

2.3 不同證型對藥物濃度的影響 即使同一疾病，因證型不同，機體對藥物體內代謝也將產生不同的影響。據中醫辨證論治理論提出的證治藥動學假說，有學者對藥物相同而“證”不同的藥代動力學參數經統計學處理后發現有明顯差別，從而影響到藥物療效和毒性反應，然而經用辨證施治后發現這種差別已消失，或較前明顯減輕[14]。可見不同證型對藥物濃度和成份將產生一定影響，因此建議在動物疾病相同和證型相同的基礎上制備含藥血清才是最科學的。

2.4 個體化的采血時點更為貼切 在含藥血清制備過程中，保證血藥濃度和藥效強弱的關鍵在于動物的給藥劑量、次數和采血時點。中藥給藥后達峰值時間可因其成分不同結果亦有差別，故采血時點尚不能統一。現階段較通用的給藥方法為1次/d，連續3～5 d，或2次/d，連續3 d，末次灌胃后1～3 h 取血。在此建議，于大部分實驗而言，需要考慮采用通用的給藥方法并結合預實驗結果進行個體化調整。

2.5 中藥復方標準及配伍機制 建立中藥復方質量的標準化，有報道的方案即首先通過中藥血清藥物化學的方法來研究確定中藥體內直接作用物質，并以此為指標再通過高效液相色譜（HPLC）、指紋圖譜等手段建立國際標準化的定性[15]。毫無疑問，這給我們深入研究中藥復方質量的標準提供了指導和方向。

中藥復方配伍科學、臨床常用且療效可靠，但對其配伍規律的現代研究尚在探索當中[16]。中藥血清藥物化學可在一定程度上解釋復方的配伍規律，其先對復方入血成分進行全面分析并確定復方藥效物質的基礎，再通過研究主要藥效成分的體內動態、成分間相互作用及消長規律[17]。總之，研究中藥復方在體內的作用形式和作用機制最好通過血清化學分析與血清藥理實驗相結合的方法[18]。

2.6 含藥血清的滅活尚有爭議 目前最常用的是水浴滅活的方法，即在進行體外實驗之前，將裝有中藥含藥血清的凍存管放置于56℃水浴中滅活30min[19]。因在新鮮制備的血清中常含有一定量的補體，它們大多數是酶原、酶及酶的抑制劑或激動劑，其具有機體防御和清除病原微生物等作用[20]。但是，藥物血清的滅活將對這部分具有一定活性的物質產生影響，繼而影響到藥理實驗結果，且無法與體內實驗和臨床用藥情況符合一致[21]。

盡管對血清滅活這一常規處理方法存在爭議，但是筆者建議最好結合預實驗，觀察滅活后和未進行滅活的含藥血清在體外實驗中的反應結果予以充分考慮。血清滅活是有必要的，因在動物含藥血清制備過程中是很難絕對防止到微生物感染的。

2.7 體外實驗中含藥血清的添加量與對照組的設定 藥物血清的藥理效應并非因動物體內給藥量越大就會越好[22]。研究發現采用不同濃度的含藥血清進行實驗時其對細胞增殖的促進或抑制作用及對細胞的毒性作用亦不相同[23]。在體外實驗中含藥血清的添加量也呈現多樣化，故在確定體外實驗中含藥血清的添加量時除參考相關文獻外，預實驗結果也可對選擇合適的添加量進行下一步實驗做出指導。原則上既要關注高濃度血清對細胞的毒性，也應考慮使含藥血清的濃度盡量接近于血藥濃度[24]。

設立空白血清作為對照組是為了避免血清本身具有的活性給實驗結果帶來影響[25]。在設立對照組時，當用一種藥物劑量（如用某中藥復方高劑量）給大鼠灌胃獲得的含藥血清，而采用不同體積分別作為不同劑量組時，對照組則應選擇相應的不同體積空白血清，且在數據處理時應以實際測得數據表示;當用不同劑量的藥物（如用某中藥復方高、中、低劑量）給予大鼠灌胃獲得的含藥血清時，應取同體積的血清作為不同藥物劑量組，則對照組僅需設立一組等體積空白血清[26]。總之，正確選擇含藥血清的添加量和設定對照組將直接關系到后續實驗的結果。課題組在進行中藥含藥血清制備時是采用中藥復方湯劑高、中、低劑量給大鼠灌胃，在設立空白血清作為對照組時用一組等體積空白血清。

3 小結

綜上，應用中藥含藥血清進行體外實驗的方法是可行的，但仍需要深入探索和研究。在對中藥及復方進行研究時，建議結合血清藥理學實驗和中藥血清藥物化學的研究結果，參考給藥后入血成分數和量的變化規律來嚴格制訂合理的給藥及采血方案，并依據血清色譜指紋圖選擇適當的方法去除血清中固有成分及內源性雜質等[27]。隨著對含藥血清成份分離和分析手段的提高，中藥血清藥理學研究將會得到進一步的發展和完善，因含藥血清成分復雜致實驗結果重復性差的問題將會得到逐步解決[28]。細節決定成敗，有時候看似極其微小的細節問題卻可能會影響到總體的結局。所以，在整個中藥含藥血清制備的全過程，一定要關注到每一個細節，以嚴謹求實的態度認真對待實驗中的各個環節，從而使制備的中藥含藥血清最大限度的模擬真實臨床狀態。

參考文獻：

[1]師少軍，陳匯，曾繁典.中藥復方藥物代謝動力學研究方法及展望[J].中國臨床藥理學雜志，2001（3）：235-238.

[2]陳賜慧，花寶金.關于中藥血清藥理學實驗的幾個問題和探討[J].中華中醫藥學刊，2013，31（1）：46-48.

[3]張軍平，張伯禮，山本清高.中藥藥物血清的制作方法探討[J].天津中醫藥，2004（4）：274-276.

[4]張聲鵬，施旭光，桂蜀華.關于中藥血清藥理學中血清供體動物是否造模的思考[J].中國中西醫結合雜志，2001（5）：388-389.

[5]劉青妍.淺論含藥血清的藥理作用強度與體內給藥量效、時效的關系[J].當代醫藥論叢，2015，13（24）：21-22.

[6]張士軍，林興，林軍，等.復方六月雪含藥血清對HepG2.2.15細胞HBsAg和HBeAg的抑制作用[J].中成藥，2007（6）：805-808..

[7]陳彩霞，汪受傳，胡鈺，等.金欣口服液對RSV感染人胚肺成纖維細胞β-干擾素mRNA和蛋白表達的影響[J].中國中西醫結合兒科學，2009，1（2）：125-129.

[8]陸海英，劉克劍，張悅，等.中藥抗纖靈方含藥血清對TGF-β1刺激的HK-2細胞c-Met及其下游MAPK信號分子的調控作用[J].中國病理生理雜志，2010，26（1）：154-157.

[9]肖政華，鄒艷，楊輝，等.扶肝化纖湯含藥血清對TGF-β1誘導HSC-T6細胞增殖及TGF-β1/Smad信號通路的影響[J].中醫雜志，2019，60（19）：1673-1678.

[10]張士軍.復方六月雪抗乙型肝炎病毒的體內外實驗研究[D].南寧：廣西醫科大學，2005.

[11]邢福有.西黃丸含藥血清抗人乳腺癌和人卵巢癌作用的研究[D].延吉：延邊大學，2007.

[12]王培.補腎明目口服液聯合糖皮質激素體外對慢性葡萄膜炎患者外周血淋巴細胞凋亡率及Fas和FasL表達的影響[D].成都：成都中醫藥大學，2009.

[13]韋振源.中藥血清藥理學在藥效研究中的應用[J].北方藥學，2012，9（9）：31-33.

[14]樊亞萱，文愛東，黃熙，等.正常及急性局部血瘀癥犬動物模型靜注磷酸四甲基吡嗪的藥動學[J].第四軍醫大學學報，1995（6）：479-480.

[15]肖秋元.大承氣湯的血清藥物化學研究[D].成都：西南交通大學，2010.

[16]陳海錦，陳子珺，都廣禮.中藥復方配伍規律的現代研究進展[J].中華中醫藥學刊，2018，36（12）：2835-2841.

[17]梅林，宋世遠.中藥血清藥物化學的研究進展[A].中國藥理學會數學藥理專業委員會.第十二屆全國數學藥理學術大會論文集[C].中國藥理學會數學藥理專業委員會：中國藥理學會，2009：3.

[18]王洪武，倪青，林蘭.中藥含藥血清的研究進展及其在中醫學中的應用[J].北京中醫藥，2008（9）：698-701.

[19]柯瑋，朱建華.中藥血清藥理方法學的研究概況[J].中國醫藥指南，2011，9（6）：24-25.

[20]陳冰.桂枝湯及其體外消化道模擬產物的藥效學研究[D].北京：中國中醫科學院，2011.

[21]翟振國.天然活性物SPA抗肺癌作用的實驗研究與機理探討[D].青島：青島大學，2001.

[22]李水芹.補陽還五湯大鼠含藥血清對肺成纖維細胞TGF-β1/Smad/ERK信號通路調控研究[D].成都：成都中醫藥大學，2014.

[23]王霖，張云，汪受傳.中藥血清藥理學研究中含藥血清添加量問題的商榷[J].山西中醫，2006（1）：51-52.

[24]殷錦錦.護肝清脂片對肝脂肪變性L02細胞模型的藥理作用及機制研究[D].廣州：南方醫科大學，2014.

[25]趙婷秀.莪術瓜蔞湯含藥血清誘導人肺癌細胞凋亡的實驗研究[D].武漢：湖北中醫學院，2004.

[26]陳健媚，郭姣.中藥血清藥理學研究進展[J].廣東藥學院學報，2016，32（3）：390-393.

[27]郭司群.地黃飲子血清藥物化學初步研究[D].哈爾濱：黑龍江中醫藥大學，2011.

[28]張良，徐立，袁冬萍，等.中藥血清藥理學方法的研究進展[J].南京中醫藥大學學報（自然科學版），2002（4）：254-256.

（收稿日期：2021-05-09）