產(chǎn)γ-聚谷氨酸菌株的篩選與培養(yǎng)基優(yōu)化

車順松，安 蕊，冉光雨，喬宗偉，邱俊杰，吳 杰，楊雷軍，畢長富，王風青

（四川輕化工大學生物工程學院，四川宜賓644005）

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）是一種由微生物生產(chǎn)的細胞外高分子氨基酸聚合物，由L-谷氨酸（L-Glu）、D-谷氨酸（D-Glu）單體通過酰胺鍵連接而成[1]。它具有成膜性[2]、可食用性[3]、生物相容性[4]、水溶性[5]、生物可降解性[6]和無毒[7]等特性，廣泛用于食品[8]、化妝品[9]、生物醫(yī)藥[10]、農(nóng)業(yè)[11]、環(huán)境[12]等領域。

γ-PGA作為食品增稠劑、穩(wěn)定劑，加入帶魚魚糜可顯著提高帶魚魚糜的凝膠強度，且對魚糜的白度值影響較小[13]；加入到冰激凌中可以改善油脂固體顆粒的分散度，減少冰晶形成，提高混料黏度，改善口感，提高膨脹率和融化率[14]；分子量低于200 kDa的γ-PGA具有極好的抗凍性，其抗凍活性明顯高于目前公認的具有高抗凍活性的葡萄糖，對需要反復凍融或者對冷凍敏感的食品有很好的保護作用[15]。γ-PGA水凝膠處理可以抑制香菇貯藏過程中的褐變，抑制PPO活性，延緩維C的降解，控制香菇的失重，保持菇體的含水量，使香菇保持良好的保鮮品質(zhì)，并延長香菇的貯藏期[16]。γ-聚谷氨酸添加于面包中，可以提高面包在貯藏期中的品質(zhì)，抑制面包的老化，延長面包的貯藏期[17]。

通過高產(chǎn)γ-PGA菌株的篩選，并對發(fā)酵條件經(jīng)行一系列優(yōu)化以實現(xiàn)高產(chǎn)γ-PGA。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酸菜水（四川、東北、湖北），黃漿水（湖北、東北），黃水（四川），傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品（四川、湖北）等。

1.1.2 試劑

CTAB，上海麥克林生化科技有限公司提供；谷氨酸鈉，成都市克隆化學藥品有限公司提供；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

（1）固體培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）。酵母浸粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，谷氨酸鈉10 g/L，瓊脂20 g/L，pH值7.4~7.6。用于產(chǎn)γ-PGA菌種的分離純化，37℃下培養(yǎng)24 h。

（2）斜面培養(yǎng)基。蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉3 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂20 g/L。用于菌種保藏，37℃下培養(yǎng)24 h。

（3）種子培養(yǎng)基。蛋白胨10 g/L，牛肉浸粉3 g/L，葡萄糖20 g/L，氯化鈉5 g/L。種子培養(yǎng)：裝液量50/250 mL，溫度37℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，搖床培養(yǎng)18 h。

（4）基礎發(fā)酵培養(yǎng)基。谷氨酸鈉40 g/L，蛋白胨5 g/L，葡萄糖50 g/L，氯化鈉10 g/L。接種量2%（V/V），裝液量50/250 mL，溫度37℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，搖床培養(yǎng)48 h。

1.2 儀器與設備

THZ-A型氣浴恒溫振蕩器、DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海助藍儀器科技有限公司產(chǎn)品；PHS-25型臺式酸度計，上海雷磁公司產(chǎn)品；YXQ-75SII型立式壓力蒸汽滅菌器、YXQ-LS-18SI型手提式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠產(chǎn)品；752N型紫外可見分光光度計，上海諾科儀器儀表有限公司產(chǎn)品；FA2004N型精密電子天平，杭州萬特衡器有限公司產(chǎn)品；R1-TGC-N50型高速離心機，無錫市瑞江分析儀器有限公司產(chǎn)品；H10-50133型生化培養(yǎng)箱，天津宏諾儀器有限公司產(chǎn)品；ZWY-2102型搖床培養(yǎng)箱，太倉市華利達實驗設備有限公司產(chǎn)品。

2 試驗方法

2.1 菌種篩選

2.1.1 初篩

分別取少量傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品、黃水、黃漿水、酸菜水，在無菌操作臺中用無菌生理鹽水稀釋，吸取0.1 mL涂布于LB平板，于37℃下恒溫培養(yǎng)24 h，挑選出形態(tài)大、表面光滑、高黏濕潤的單菌落，將挑選出來的單菌落再次在固體分離培養(yǎng)基上進行三區(qū)劃線，于37℃下恒溫培養(yǎng)24 h，挑選出具有相同特點的單菌落，并且接種到斜面上。

2.1.2 復篩

取斜面保藏的初篩菌種，轉(zhuǎn)接入50 mL/250 mL裝液量的種子培養(yǎng)液，在溫度37℃，轉(zhuǎn)速150 r/min條件下，搖床振蕩培養(yǎng)10 h，然后按2%的接種量轉(zhuǎn)接到50 mL/250 mL裝液量的酵培養(yǎng)基中，在溫度37℃，轉(zhuǎn)速150 r/min條件下，振蕩培養(yǎng)48 h，發(fā)酵結(jié)束后測定γ-PGA的產(chǎn)量。

2.1.3 生長曲線測定

選取復篩菌株中γ-PGA產(chǎn)量最高的菌株接種至50 mL/250 mL裝液量的種子培養(yǎng)液，于37℃下以轉(zhuǎn)速150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。按2%接種量接種至50 mL/250 mL裝液量的種子培養(yǎng)液，37℃下以轉(zhuǎn)速150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣，于波長600 nm處測定其吸光度，記錄數(shù)據(jù)并繪制其生長曲線。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌落及菌體形態(tài)特征鑒定

（1）菌落形態(tài)特征。觀察菌株在LB平板上37℃下恒溫培養(yǎng)24 h的菌落形態(tài)特征。

（2）菌體形態(tài)特征。取平板上培養(yǎng)了24 h的菌種進行革蘭氏染色，將制備好的樣片置于顯微鏡下觀察，拍照記錄。

2.2.2 生理生化管鑒定

在無菌操作臺中，用接種環(huán)從斜面培養(yǎng)基上分別挑取適量菌體于蔗糖、半乳糖、七葉苷、乳糖等21種生化管中，再用滅菌后的棉花團塞住，培養(yǎng)24 h后對比其與初始管的顏色變化，從而鑒別細菌的菌屬。

2.2.3 細菌16S DNA鑒定

將復篩中γ-PGA產(chǎn)量最高的菌株送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行16S DNA測序。

2.2.4 CTAB比濁法測定聚谷氨酸

γ-PGA可與十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）的氫氧化鈉溶液反應形成混懸液，CTAB溶液質(zhì)量濃度為2 g/L，反應溫度為環(huán)境溫度，絡合時間為3 min，于波長250 nm處測定其吸光度[18]。

（1）CTAB-NaOH溶液的配置。準確稱取5 g NaOH于燒杯中，加入少量純凈水完全溶解后轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用純凈水定容至100 mL，再準確稱取0.2 g CTAB于NaOH溶液中，待藥品完全溶解后，裝入小藥瓶中低溫干燥環(huán)境下放置備用。

（2）γ-PGA標準曲線的測定。準確稱取0.010 0 g γ-PGA標準品，用蒸餾水或去離子水定容至50 mL，配置成200 μg/mL的γ-PGA母液，用母液稀釋配置成5，10，15，20，25，30，35，40 μg/mL的γ-PGA溶液，分別與2 g/L的CTAB溶液（用5%的NaOH溶液配制）1∶1混合，反應3 min左右，于波長250 nm處測定其吸光度，以γ-PGA質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

（3）γ-PGA粗品測定。將發(fā)酵液稀釋后，取2 mL稀釋的發(fā)酵液加入2 mL離心管中，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心3 min后取出，加入等體積十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）的氫氧化鈉溶液反應形成混懸液，絡合3 min左右于波長250 nm處測定吸光度，并帶入標準曲線得出實際產(chǎn)量。

2.3 γ-PGA液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.3.1 氮源種類及濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響

在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入5 g/L的蛋白胨、大豆分離蛋白、胰蛋白酶胨、牛肉浸粉、酵母浸粉、硫酸銨、氯化銨、檸檬酸三銨、尿素為氮源，其他成分與基礎發(fā)酵培養(yǎng)基一致，50 mL/250 mL裝液量，2%接種量，37℃下以轉(zhuǎn)速150 r/min搖床培養(yǎng)48 h后測定發(fā)酵液中γ-PGA的含量，確定最優(yōu)氮源種類。最優(yōu)種類氮源進行3，4，5，6，7，8 g/L的梯度培養(yǎng)，確定最佳氮源質(zhì)量濃度。

2.3.2 碳源的種類及質(zhì)量濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響

在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入50 g/L的葡萄糖、糊精、玉米糖化液、蔗糖、尿素、檸檬酸三銨為碳源，氮源以優(yōu)化后為準，其他成分與基礎發(fā)酵培養(yǎng)基一致，50 mL/250 mL裝液量，2%接種量，37℃下以轉(zhuǎn)速150 r/min搖床培養(yǎng)48 h后測定發(fā)酵液中γ-PGA的含量，確定最優(yōu)碳源，最優(yōu)碳源進行30，40，50，60，70，80 g/L梯度培養(yǎng)，確定最佳碳源質(zhì)量濃度。

2.3.3 前提物谷氨酸鈉質(zhì)量濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響

在基礎培養(yǎng)基中分別加入20，30，40，50，60，70 g/L的谷氨酸鈉，碳源、氮源以優(yōu)化后的為準，其他成分與基礎發(fā)酵培養(yǎng)基一致，培養(yǎng)方法同上，測定其最佳質(zhì)量濃度。

2.3.4 氯化鈉質(zhì)量濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響

在基礎培養(yǎng)基中分別加入6，8，10，12，14，16 g/L的氯化鈉，碳源、氮源、前提物以優(yōu)化后為準，培養(yǎng)方法同上，測定其最佳質(zhì)量濃度。

2.3.5 金屬離子的種類及質(zhì)量濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響

在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中分別梯度添加如下3種金屬離子：

（1）硫酸鎂（W/V）。0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%；

（2）磷酸氫二鉀。0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，1.4%；

（3）硫酸錳。0.002%，0.004%，0.006%，0.008%，0.010%，0.012%。

50 mL/250 mL裝液量，2%接種量，150 r/min搖床，于37℃下培養(yǎng)48 h后測定發(fā)酵液γ-PGA含量，確定最優(yōu)金屬離子種類及質(zhì)量濃度。

2.3.6 最佳發(fā)酵時間的確定

在優(yōu)化后的培養(yǎng)基的基礎上，50 mL/250mL裝液量，分別接入2%的種子液，轉(zhuǎn)速150 r/min，37℃下培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24，48，72，96 h，測定γ-PGA含量，確定最佳發(fā)酵時間。

3 結(jié)果與分析

3.1 γ-PGA生產(chǎn)菌的篩選與鑒定

3.1.1 γ-PGA的生產(chǎn)菌篩選

從傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品、黃水、黃漿水、酸菜水等多種材料中，經(jīng)過平板初篩得到8株菌落直徑大而濕潤、黏稠的菌株。初篩菌株發(fā)酵48 h，測γ-PGA的產(chǎn)量，γ-PGA產(chǎn)量最高得菌株即為目標菌株。

菌株篩選見圖1。

圖1 菌株篩選

3.1.2 菌株Y8的鑒定

（1）菌株Y8的菌落和菌體形態(tài)特征。對菌株Y8的菌落形態(tài)、革蘭氏染色、芽孢染色等特征進行了觀察。該菌株在LB平板上培養(yǎng)24 h后，菌落呈無色到乳白色、半透明、圓形、突起、邊緣齊整，直徑4~5 mm，表面光滑、黏稠、能拉絲。顯微鏡觀察后，其菌體個體較大，直桿狀，大小一般在1.7~2.1×0.5~0.8 μm，革蘭氏染色陽性，有芽孢。

3.1.3 生理生化管鑒定結(jié)果

對YB18菌株菌種進行細胞形態(tài)觀察及生理生化特征試驗，該菌株細胞形態(tài)為桿狀、革蘭氏染色陽性，可形成芽孢、孢囊不膨大，接觸酶陽性、氧化酶陽性，能夠利用α-D-葡萄糖、明膠、D-麥芽糖、D-果糖-6-磷酸、D-海藻糖、D-半乳糖醛酸、半乳糖酸內(nèi)酯、葡萄糖醛酰胺、β-甲基-D-葡糖苷、N-乙酰-D-葡糖胺、蔗糖、龍膽二糖、甘油、肌醇、D-甘露醇、D-山梨醇、松三糖、D-甘露糖、D-果糖、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-焦谷氨酸、L-絲氨酸、果膠、D-葡糖酸、粘酸、糖質(zhì)酸、L-乳酸、檸檬酸、L-蘋果酸、糊精、甲酸生長，不能利用D-葡萄糖-6-磷酸、D-纖維二糖、D-葡萄糖醛酸、甘氨酸-L-脯氨酸、β-羥基-D,L-丁酸、D-半乳糖、肌苷、L-鼠李糖、L-巖藻糖、D-巖藻糖、D-水楊苷、水蘇糖、D-棉子糖、α-D-乳糖、D-蜜二糖、乙酸、丙酸、乙酰乙酸、α-丁酮酸、α-羥丁酸、γ-氨基丁酸生長，對萘啶酸、萬古霉素、林可霉素、1%乳酸鈉、醋竹桃霉素、十四烷硫酸鈉敏感。

生理管鑒定結(jié)果見表1。

表1 生理管鑒定結(jié)果

參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》第8版對芽孢桿菌的闡述結(jié)合對該菌株的觀察，確定該菌為芽孢桿菌屬。

3.1.4 分子生物學鑒定

菌株16S rDNA測序及比對結(jié)果如下：

所測菌株與數(shù)據(jù)庫里對比相似度最高的是：Bacillus subtilis。將此菌株命名為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisYB18。

3.2 培養(yǎng)優(yōu)化

3.2.1 γ-PGA生產(chǎn)菌生長曲線的測定

選取復篩菌株中γ-PGA產(chǎn)量最高的菌株接種至50 mL/250 mL裝液量的種子培養(yǎng)液，于37℃下以轉(zhuǎn)速150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。按2%接種量接種至50 mL/250 mL裝液量的種子培養(yǎng)液，于37℃下以轉(zhuǎn)速150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣，于波長600 nm處測定其吸光度，記錄數(shù)據(jù)并繪制其生長曲線。

由圖2可知，在0~14 h，菌體數(shù)量主要呈上升趨勢，10 h后進入生長對數(shù)期，12 h后逐漸進入穩(wěn)定期，14 h時達到最大值，之后進入衰亡期，結(jié)果表明種子液的培養(yǎng)時間為10 h。

γ-PGA生產(chǎn)菌的生長曲線見圖2。

圖2 γ-PGA生產(chǎn)菌的生長曲線

3.2.2 氮源種類及質(zhì)量濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)基不同種類氮源質(zhì)量濃度均為5 g/L，其他成分及質(zhì)量濃度與基礎發(fā)酵培養(yǎng)基相同。接種量2%，裝液量50 mL/250 mL，于37℃下以轉(zhuǎn)速150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，測定不同物質(zhì)作為氮源時發(fā)酵液中γ-PGA的含量。

氮源種類對γ-PGA產(chǎn)量的影響見圖3。

圖3 氮源種類對γ-PGA產(chǎn)量的影響

由圖3可知，牛肉浸粉作為氮源的發(fā)酵液中γ-PGA產(chǎn)量最高，由此可見牛肉浸粉為最優(yōu)氮源。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基加入牛肉浸粉作為氮源，設置牛肉浸粉質(zhì)量濃度梯度，其他條件同上，培養(yǎng)48 h，測定γ-PGA產(chǎn)量，得牛肉浸粉質(zhì)量濃度與γ-PGA產(chǎn)量關系圖。

牛肉浸粉質(zhì)量濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響見圖4。

圖4 牛肉浸粉質(zhì)量濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響

γ-PGA產(chǎn)量在牛肉浸粉質(zhì)量濃度為11g/L時出現(xiàn)最大值4.05 g/L，之后產(chǎn)量下降，由此可得牛肉浸粉最優(yōu)質(zhì)量濃度為11 g/L。

3.2.3 碳源種類及質(zhì)量濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響

在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入50g/L的葡萄糖、糊精、玉米糖化液、蔗糖、尿素、檸檬酸三銨為碳源，氮源以優(yōu)化后為準，其他成分與基礎發(fā)酵培養(yǎng)基一致，50 mL/250 mL裝液量，2%接種量，37℃下以轉(zhuǎn)速150 r/min搖床培養(yǎng)48 h后測定發(fā)酵液中γ-PGA的含量，確定最優(yōu)碳源。

碳源種類對γ-PGA產(chǎn)量的影響見圖5。

由圖5可知，其中玉米糖化液作為碳源時γ-PGA產(chǎn)量最大，最大產(chǎn)量為1.02 g/L，由此可得最優(yōu)碳源為玉米糖化液。

圖5 碳源種類對γ-PGA產(chǎn)量的影響

以玉米糖化液為碳源，設置玉米糖化液質(zhì)量濃度梯度，相同條件培養(yǎng)48 h，測定γ-PGA產(chǎn)量。

玉米糖化液質(zhì)量濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響見圖6。

圖6 玉米糖化液質(zhì)量濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響

由圖6可知，玉米糖化液質(zhì)量濃度為100g/L時γ-PGA產(chǎn)量最大，最大產(chǎn)量為5.04g/L，由此可得玉米糖化液最優(yōu)質(zhì)量濃度為100g/L。

3.2.4 前體物谷氨酸鈉質(zhì)量濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響

在基礎培養(yǎng)基中分別加入20，30，40，50，60，70 g/L的谷氨酸鈉，碳源、氮源以優(yōu)化后的為準，其他成分與基礎發(fā)酵培養(yǎng)基一致，培養(yǎng)方法如前，測定其最佳質(zhì)量濃度，48 h后測定γ-PGA產(chǎn)量。

前體物質(zhì)量濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響見圖7。

圖7 前體物質(zhì)量濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響

由圖7可知，前體物質(zhì)量濃度為30 g/L時γ-PGA產(chǎn)量最大，最大產(chǎn)量為5.25 g/L，由此可得前體物聚氨酸鈉最優(yōu)質(zhì)量濃度為30 g/L。

3.2.5 氯化鈉質(zhì)量濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響

在基礎培養(yǎng)基中分別加入6，8，10，12，14，16 g/L的氯化鈉，碳源、氮源、前提物以優(yōu)化后為準，培養(yǎng)方法同上，48 h后測定γ-PGA產(chǎn)量。

氯化鈉質(zhì)量濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響見圖8。

圖8 氯化鈉質(zhì)量濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響

由圖8可知，氯化鈉濃度為10 g/L時γ-PGA產(chǎn)量最大，5.87 g/L，由此可得氯化鈉最優(yōu)質(zhì)量濃度為10 g/L。

3.2.6 金屬離子的種類及質(zhì)量濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響

在以上培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎上，選擇硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸錳3種金屬化合物作為金屬離子的添加藥品，分別設置其質(zhì)量濃度梯度，培養(yǎng)方法同上，48 h后測定γ-PGA產(chǎn)量。

硫酸鎂質(zhì)量濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響見圖9，磷酸二氫鉀質(zhì)量濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響見圖10，硫酸錳質(zhì)量濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響見圖11。

圖9 硫酸鎂質(zhì)量濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響

圖10 磷酸二氫鉀質(zhì)量濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響

由圖9~圖11可知，磷酸二氫鉀質(zhì)量濃度為0.3 g/L時γ-PGA產(chǎn)量最大，11.78 g/L，由此可得最優(yōu)金屬離子為鉀離子，磷酸二氫鉀最優(yōu)質(zhì)量濃度為0.3 g/L。

圖11 硫酸錳質(zhì)量濃度對γ-PGA產(chǎn)量的影響

3.2.7 發(fā)酵時間對γ-PGA產(chǎn)量的影響

使用以上優(yōu)化培養(yǎng)基，設置發(fā)酵時間梯度，測定不同發(fā)酵時間發(fā)酵液中γ-PGA含量。

發(fā)酵時間對γ-PGA產(chǎn)量的影響見圖12。

圖12 發(fā)酵時間對γ-PGA產(chǎn)量的影響

由圖12可知，發(fā)酵時間為72 h時γ-PGA由最大產(chǎn)量24.27 g/L，由此可得最優(yōu)發(fā)酵時間為72 h。

4 結(jié)論

從傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品、黃水、黃漿水、酸菜水中篩選出一株γ-PGA產(chǎn)生菌株，經(jīng)形態(tài)分析、生理管鑒定和16S rDNA序列鑒定為枯草芽孢桿菌，并將此菌株命名為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisYB18.）設計梯度試驗對培養(yǎng)基各個成分進行了優(yōu)化，在試驗條件下該菌株的最佳氮源為牛肉浸粉，其最佳質(zhì)量濃度為11 g/L；最佳碳源為玉米糖化液，其最佳質(zhì)量濃度為100 g/L；谷氨酸鈉作為前體物，其最佳質(zhì)量濃度為30 g/L；氯化鈉最佳質(zhì)量濃度為10 g/L；最優(yōu)金屬離子為磷酸二氫鉀所提供的鉀離子，其最佳質(zhì)量濃度為0.3 g/L，最佳發(fā)酵時間為72 h，采用優(yōu)化培養(yǎng)基配方進行發(fā)酵，所得γ-PGA的產(chǎn)量為24.27 g/L。