雙酶法提取大蒜水溶性膳食纖維及其抗氧化活性分析

張 云，苗敬芝，2，董玉瑋，2，李 勇，2，鄧錦慧，羅 姣

（1.徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，江蘇徐州221018；2.江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州221018）

0 引言

大蒜為百合科蔥屬植物蒜的鱗莖，是一種藥食同源的蔬菜[1]。大蒜含有多種生物活性物質(zhì)，主要有氨基酸、膳食纖維、大蒜素、黃酮類(lèi)、維生素、微量元素等，具有抗菌消炎、抗氧化防衰老、清除體內(nèi)自由基、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等生理功能[2-4]。膳食纖維根據(jù)其溶解性不同，分為水溶性膳食纖維（SDF）和水不溶性膳食纖維（IDF）兩大類(lèi)。研究表明，水溶性膳食纖維對(duì)人體有多種生理功效，如增強(qiáng)腸道益生菌群、防癌抗癌、降血糖、降血脂、預(yù)防糖尿病等[5-7]。

試驗(yàn)采用雙酶法提取大蒜水溶性膳食纖維，利用酶的專(zhuān)一性、高效性、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)勢(shì)，縮短提取時(shí)間、提高提取效率[8]，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化大蒜水溶性膳食纖維的提取工藝條件，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究，為大蒜的綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大蒜，購(gòu)于徐州華聯(lián)超市；纖維素酶（50 000 U/g）、木瓜蛋白酶（50 000 U/g），江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司提供；抗壞血酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、DPPH、鄰苯三酚、95%乙醇等，均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9075A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海慧泰儀器制造有限公司產(chǎn)品；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司產(chǎn)品；723G型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海分析儀器有限公司產(chǎn)品；TDL-6型低速大容量離心機(jī)，金壇晨陽(yáng)電子儀器廠(chǎng)產(chǎn)品；SENCO型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大蒜SDF提取工藝流程

大蒜→去皮、清洗→切片、護(hù)色（0.5%抗壞血酸）→烘干、粉碎，過(guò)篩→稱(chēng)取樣品→按一定料液比加檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液→加纖維素酶和木瓜蛋白酶→酶解→滅酶→過(guò)濾，取濾液，加入4倍體積95%乙醇醇沉→過(guò)濾、濾渣干燥，稱(chēng)質(zhì)量→成品。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

設(shè)置纖維素酶加酶量、木瓜蛋白酶加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

大蒜SDF提取單因素試驗(yàn)見(jiàn)表1。

表1 大蒜SDF提取單因素試驗(yàn)

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，考查纖維素酶加酶量、木瓜蛋白酶加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度對(duì)大蒜SDF得率的影響。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.4 大蒜SDF抗氧化活性分析

（1）對(duì)O2-自由基清除率的測(cè)定[9]。分別取不同質(zhì)量濃度大蒜SDF各2.00 mL，依次加入0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH值8.2）4.0 mL置于試管中，于25℃下水浴20 min，加2.5 mmol/L鄰苯三酚溶液2 mL，充分混勻，于25℃下反應(yīng)5 min，加8%的鹽酸溶液2 mL終止反應(yīng)。以蒸餾水作空白試驗(yàn)，于波長(zhǎng)325 nm處測(cè)定吸光度。計(jì)算不同質(zhì)量濃度的大蒜SDF對(duì)O2-自由基的清除率。

式中：A1——樣品的吸光度；

A0——空白品的吸光度。

（2）對(duì)DPPH自由基清除率的測(cè)定[10]。分別取不同質(zhì)量濃度大蒜SDF各2.00 mL，依次加入0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL，于25℃下反應(yīng)25 min，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度。以蒸餾水作空白試驗(yàn)，以相同質(zhì)量濃度的維C溶液作對(duì)比，計(jì)算不同質(zhì)量濃度大蒜SDF對(duì)DPPH的清除率。

式中：A1——樣品的吸光度；

A0——空白品的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)條件選擇

2.1.1 纖維素酶加酶量纖維素酶加酶量對(duì)大蒜SDF得率的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著纖維素酶加酶量的增加，大蒜SDF得率先增后降，1.6%時(shí)得率最高為29.5%。在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著酶質(zhì)量濃度增加，酶與底物接觸幾率增加，酶與底物質(zhì)量濃度最合適時(shí)，有利于水溶性膳食纖維的釋放，酶質(zhì)量濃度過(guò)高，底物質(zhì)量濃度不足，酶解效率降低[11]。因此，纖維素酶最適加酶量為1.6%。

圖1 纖維素酶加酶量對(duì)大蒜SDF得率的影響

2.1.2 木瓜蛋白酶加酶量

由圖2可知，隨著木瓜蛋白酶加酶量的增加，大蒜SDF得率上升，2.2%時(shí)得率最高為28.8%，之后呈下降趨勢(shì)。因此，木瓜蛋白酶最適加酶量為2.2%。

圖2 木瓜蛋白酶加酶量對(duì)大蒜SDF得率的影響

2.1.3 酶解時(shí)間

酶解時(shí)間對(duì)大蒜SDF得率的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，隨著酶解時(shí)間增加，大蒜SDF得率上升，180 min時(shí)達(dá)到最高為30.50%，之后呈下降趨勢(shì)，可能隨著時(shí)間延長(zhǎng)，大蒜SDF部分降解。因此，最適酶解時(shí)間為180 min。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)大蒜SDF得率的影響

2.1.4 酶解溫度

酶解溫度對(duì)大蒜SDF得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 酶解溫度對(duì)大蒜SDF得率的影響

由圖4可知，隨著酶解溫度升高大蒜SDF得率上升，溫度50℃時(shí)達(dá)到最高為30.60%，之后下降。溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，使溶質(zhì)快速溶出，大蒜SDF得率提高，溫度過(guò)高，酶分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，酶活性降低，影響酶促反應(yīng)的進(jìn)行，大蒜SDF得率下降[12]。因此，最適酶解溫度為50℃。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化大蒜SDF提取工藝條件

大蒜SDF提取正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 大蒜SDF提取正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，各單因素對(duì)大蒜SDF得率的影響大小順序?yàn)锽>A>D>C，即木瓜蛋白酶加酶量>纖維素酶加酶量>酶解溫度>酶解時(shí)間。大蒜SDF最佳提取工藝條件是A3B2C2D3，即纖維素酶加酶量2.2%，木瓜蛋白酶加酶量2.2%，酶解時(shí)間180 min，酶解溫度55℃。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，取其平均值大蒜SDF得率為32.06%。

2.3 大蒜SDF抗氧化活性分析結(jié)果

2.3.1 大蒜SDF對(duì)O2-自由基的清除效果

大蒜SDF對(duì)O2-自由基的清除效果見(jiàn)圖5。

圖5 大蒜SDF對(duì)O2-自由基的清除效果

由圖5可知，隨著大蒜SDF質(zhì)量濃度的增加對(duì)O2-自由基的清除率增大，當(dāng)大蒜SDF質(zhì)量濃度0.7 mg/mL時(shí)，清除率80.01%，清除效果明顯，之后清除率變化緩慢。

2.3.2 大蒜SDF對(duì)DPPH自由基的清除效果

大蒜SDF對(duì)DPPH自由基的清除效果見(jiàn)圖6。

圖6 大蒜SDF對(duì)DPPH自由基的清除效果

由圖6可知，隨著大蒜SDF質(zhì)量濃度的增加對(duì)DPPH自由基的清除率增大，當(dāng)大蒜質(zhì)量濃度0.7 mg/mL時(shí)，清除率80.15%，之后清除率變化緩慢，說(shuō)明大蒜SDF對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力。

3 結(jié)論

（1）通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化大蒜SDF提取的工藝條件，各因素對(duì)大蒜SDF得率的影響大小順序?yàn)锽>A>D>C，即木瓜蛋白酶加酶量>纖維素酶加酶量>酶解溫度>酶解時(shí)間；大蒜SDF最佳提取工藝條件是A3B2C2D3，即纖維素酶加酶量2.2%，木瓜蛋白酶加酶量2.2%，酶解時(shí)間180 min，酶解溫度55℃，大蒜SDF得率為32.06%。

（2）大蒜SDF對(duì)O2-自由基和DPPH自由基均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，且隨著質(zhì)量濃度的增加清除率增大，呈明顯的量效關(guān)系。表明它是一種優(yōu)質(zhì)的食物纖維，可作為一種天然綠色的食品添加劑，添加到乳制品、焙烤制品、飲料等產(chǎn)品中，具有良好的應(yīng)用前景。