三株香豬源多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定

張瑞華，高善頌，李煥發，張丹萍，竇心怡，韓先杰

（青島農業大學動物醫學院，山東 青島 266109）

豬巴氏桿菌病又被稱為豬肺疫［1］，在遼寧、青海、四川、上海、湖南、湖北等地常有發生，給我國生豬養殖業造成了重大的經濟損失。在對該病的診斷治療和防控過程中，豬源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定和血清型鑒定是不可或缺的一部分。多殺性巴氏桿菌通常存在于各種動物的口腔和咽部粘膜中，當各種原因引起動物應激反應或者導致動物機體抵抗力降低時，該菌會迅速生長繁殖引起動物患病，并發生內源性感染［2］，還可與豬傳染性胸膜肺炎、豬偽狂犬病、豬喘氣病、豬鏈球菌病等發生繼發感染或混合感染［3］。

2019年1月某規模化香豬場有5頭病死小香豬送檢，為確定病原并為其用藥提供參考，本研究從送檢病例中分離到3株細菌，經鑒定均為A型多殺性巴氏桿菌，并對其進行了藥物敏感性試驗等。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細菌來源 采集于青島某豬場病死香豬的肺臟。

1.1.2 主要試劑 PCR試劑等購自青島紫恩生物科技有限公司；藥敏紙片購自青島科盛源科技發展有限公司；腦心浸液肉湯培養基、綿羊血瓊脂培養基、生化試劑等購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌的分離及形態觀察 將病死豬肺臟置于超凈工作臺中，使用無菌接種環蘸取細支氣管中分泌物，劃線接種于綿羊血瓊脂培養基上，至恒溫培養箱中培養16～18 h，觀察生長情況。培養結束后挑取單個菌落至載玻片上，對其進行革蘭氏染色并使用油鏡觀察細菌形態。

1.2.2 生化試驗 挑取分離菌接種到腦心浸液肉湯培養基中增殖培養，取培養完成的菌液離心洗滌后接種到細菌微量發酵管中，37℃恒溫箱中培養16～22 h，培養完成后查看并記錄生化反應結果。

1.2.3 16S rRNA基因的擴增 使用煮沸法提取細菌DNA，用于擴增細菌16S rRNA基因序列的通用引物［4］見表1，由青島派森諾基因生物技術有限公司合成。PCR擴增體系（25μL）:2×TaqMaster Mix 12.5μL，上下游引物各1.5μL，DNA模板2.5μL，去離子水7.0μL。PCR擴增程序:95℃預變性1 min；95℃變性15 s，53℃退火15 s，72℃延伸2 min，共34個循環；72℃延伸7 min；10℃終止反應。

表1 擴增16S rRNA基因通用引物序列

1.2.4 PCR產物測序 由青島派森諾基因科技有限公司對PCR擴增產物進行測序。利用NCBI的BLAST工具進行序列的同源性比對，利用MEGA 6軟件進行進化分析。

1.2.5 細菌血清型鑒定 5對鑒定血清型的引物序列［5］見表2。PCR擴增體系（25μL）:上下游引物各1.0μL，DNA模板2.0μL，2×TaqMaster Mix 12.5μL，滅菌去離子水8.5μL。PCR擴增程序:94℃預變性3 min；94℃變性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸75 s，共32個循環；72℃延伸7 min；4℃結束反應并保存。

表2 鑒定血清型的引物序列

1.2.6 動物試驗 挑取單菌落接種到腦心浸液肉湯培養基中，封上封口膜后放入37℃恒溫振蕩培養箱中培養16～22 h，并計算活菌數。設置濃度分別為104、105、106cfu/mL攻毒組和對照組，每處理隨機選取8只健康小白鼠，對照組不做任何處理，攻毒組腹腔注射菌液均為0.3 mL。連續3 d觀察死亡情況，采用改良寇氏法計算LD50值。

1.2.7 藥敏試驗 藥敏試驗根據Kirby－Bauer法進行，按照相關標準［6］和青島科盛源科技發展有限公司提供的紙片法藥敏試驗指導進行藥物敏感性判定。

2 結果與分析

2.1 細菌分離與形態觀察

從肺臟中共分離出3株菌，在綿羊血瓊脂培養基上經過37℃培養24 h，菌落呈灰白色、濕潤、半透明的露珠狀，不溶血（圖1）。革蘭氏染色呈陰性，形態為兩端鈍圓的短桿菌（圖2）。將本試驗分離菌分別命名為SD－PM07、SD－PM08和SD－PM09。

圖1 綿羊血瓊脂培養基上分離菌菌落

圖2 分離菌菌體形態（1 000×）

2.2 生化試驗結果

分離菌SD－PM07、SD－PM08、SD－PM09的生化試驗結果一致（表3），與巴氏桿菌的生化特征相符［7］。

表3 生化試驗結果

2.3 細菌16S rRNA基因的擴增

擴增結果（圖3）顯示，3株分離菌均擴增出大小約為1 500 bp的目的DNA，與預期大小相符。

圖3 分離菌16S rRNA基因擴增結果

2.4 基因測序分析

同源性比對結果顯示，分離菌與多殺性巴氏桿菌（GenBank序列號CP048402）同源性為99.9%，結合形態觀察和生化試驗結果，可確定分離菌株為多殺性巴氏桿菌。由序列進化樹（圖4）可知，3株分離菌單獨處在小的分支上，其遺傳進化來源還需進一步研究。

圖4 分離菌株基于16S rRNA基因序列的進化樹分析

2.5 血清型鑒定

莢膜血清型鑒定結果（圖5）表明，3株分離菌均是A型血清型。

圖5 分離菌株莢膜血清型鑒定

2.6 致病性試驗結果

本試驗分離菌株的LD50為1.8×105cfu/mL。對死亡小鼠進行病理解剖發現其肝腫大、有壞死點，肺充血、有出血點，小腸壁薄、有出血點，大腸壁上有出血點。切取部分發病組織進行涂片，革蘭氏染色后使用油鏡觀察，視野中呈現大量革蘭氏陰性短桿菌。

2.7 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果（表4）表明，分離菌對頭孢他啶、慶大霉素、頭孢哌酮、鏈霉素、左氧氟沙星、卡那霉素、頭孢曲松、哌拉西林、氨芐西林、頭孢噻肟敏感；對強力霉素中度敏感；對氧氟沙星耐藥。

表4 分離菌藥物敏感試驗結果

3 討論與結論

經生化試驗、16S rRNA基因序列分析及血清型鑒定，3株分離菌均為多殺性巴氏桿菌A型。藥敏試驗結果顯示，分離菌株主要對β內酰胺類抗生素敏感。

經分析，該豬場主要由于飼養環境差導致細菌感染。豬多殺性巴氏桿菌可通過豬飼料、飲水以及空氣等進入機體進行感染［8］；飼養管理不當、環境衛生差導致動物機體抵抗力下降，從而更容易使病原菌侵入動物血液引發感染、死亡。因此，日常需要加強飼養管理，做好圈舍衛生以及消毒工作等，以防止病原體入侵。