非洲豬瘟病毒編碼蛋白功能及疫苗研究進展

安一娜 楊靜靜 高 敏 董彥君

中國農業大學動物醫學院，北京100193

ASF 是ASFV 感染引發的豬類疾病，患病豬表現為高熱、心率加快、呼吸困難、皮膚發紺、脾及淋巴結等免疫器官水腫出血；不同毒力的毒株感染會導致不同的臨床表現，感染后通常在3～10 d 內死亡，家豬死亡率接近100%。

ASFV屬DNA 雙鏈目，非洲豬瘟病毒屬，是非洲豬瘟病毒科中唯一的DNA 蟲媒病毒，這種病毒可通過直接或間接接觸感染多種真核生物；ASFV 主要侵染豬的巨噬細胞，感染后，病毒的早期復制集中于細胞核，隨后轉移到細胞質中完成剩下的復制過程，ASFV 基因組龐大，隨著近幾年相關研究的開展，病毒蛋白的結構及功能逐漸清晰，但仍有大量蛋白功能尚不清楚，這極大地制約了對ASF 的防控。2019年相關綜述總結了50 個已知功能的AS?FV 編碼蛋白[1-11]。近年來，相關研究取得了巨大進展，所以本文將對目前已知功能的91 種ASFV 編碼蛋白及ASF 相關疫苗的研究進展進行歸納總結，以期為揭示ASFV 致病機制及ASF 疫苗開發提供相關信息。

1 ASFV病毒特性

1.1 形態結構

ASFV 是一種由多層同心結構域組成的大型雙鏈DNA 病毒，外觀呈20 面體形態，平均直徑為220 nm[1-2]。ASFV 獨有的5 層結構由內而外分別為類核、核殼、內囊膜、核衣殼、外囊膜。病毒的中心是由線性DNA 雙鏈裝配而成的類核，直徑為70～100 nm，包含病毒基因組和核蛋白，如DNA 結合蛋白p10 和pA104R，類核包含了合成和修飾早期所需的轉錄因子，其中包括多亞基RNA 聚合酶、帽狀酶和早期轉錄因子；類核的外層被核殼蛋白包裹，核殼是一層厚約30 nm 的蛋白質層，該結構域主要由聚蛋白pp220 和pp62 的加工產物以及pS273R 蛋白構成[2]；核殼的外周附著一層脂質包膜稱為內囊膜，內囊膜主要來源于內質網，蛋白p54[3]、p17[4]和pE248R[5]是其主要組成成分；內囊膜的外層為核衣殼，衣殼的外觀為長13 nm、寬5～6 nm 的六角形棱柱狀，間距為7.4 nm，中間有一個中心孔[1]，蛋白p72和pE120R 是核衣殼的主要成分[6]；病毒顆粒的最外層為外囊膜，它是病毒通過質膜出芽時獲得的[7]，有報 道稱p12[8]、CD2v（pE402R）[9]、p24[10]等均 定 位于外膜。

1.2 編碼蛋白

ASFV 基因共編碼151～167 個開放閱讀框（open reading frames，ORFs）。通過查閱NCBI的AS?FV基因文庫發現，目前ASFV 編碼的蛋白有159種，其中已知功能的有91 種，預測功能的有9 種，未知功能的有59 種。將這些已知功能的蛋白按其在感染宿主時發揮的作用可分為六類，分別是：病毒結構蛋白及參與病毒形態發生的蛋白；參與病毒入侵的蛋白；病毒進入細胞后參與病毒復制、mRNA轉錄的酶和因子；參與宿主機體免疫調控的蛋白；參與跨膜的蛋白以及多基因家族編碼的病毒蛋白[11]（圖1-2）。

圖1 ASFV編碼蛋白功能分類［12］

圖2 非洲豬瘟編碼蛋白分布

2 ASFV感染過程中的相關蛋白

ASFV 復制包括立即-早期-中期-晚期4 個階段。ASFV 主要依賴大胞飲、網格蛋白介導的內吞作用進入巨噬細胞，然后沿微管系統被傳送至細胞核周圍，隨后進入核開啟病毒復制，早期的表達產物會分布在核周形成病毒工廠；病毒感染晚期，波形蛋白和線粒體包裹著病毒DNA、膜蛋白、結構蛋白和部分宿主蛋白被招募至病毒工廠，包裝形成的病毒粒子利用微管離開病毒工廠到達細胞膜，通過出芽的方式被釋放至細胞外（圖3）。

圖3 ASFV感染過程

2.1 ASFV復制過程

1）ASFV 吸附與入侵。ASFV 感染周期始于病毒吸附、入侵宿主細胞。由O61R 基因編碼的ASFV p12蛋白，是病毒感染晚期表達的內膜蛋白；研究發現，純化的ASFV p12 蛋白與易感的Vero 細胞作用后能夠抑制ASFV 與Vero 的結合，表明p12 和ASFV能夠識別共同的細胞受體，p12介導ASFV與宿主細胞的吸附，但其發揮作用的機制還有待研究[13]。除p12外，由CP204L、E183L基因編碼的病毒早期膜蛋白ASFV p32、ASFV p54 以及由B646L 基因編碼的衣殼蛋白ASFV p72 均在病毒吸附和入侵易感細胞方面具有重要作用。Gomez-Puertas 等[14]發現，抗p72 和抗p54 的血清均能抑制約60%的ASFV 對Ve?ro 細胞和豬巨噬細胞的吸附；抗p32 血清盡管不能抑制病毒吸附，但能抑制95%病毒的入侵。由EP402R 基因編碼的ASFV CD2v 蛋白是病毒外膜蛋白，具有類似于黏附受體CD2 的結構，所以能夠吸附具有CD2 配體的豬紅細胞[15]。此外，pEP153R 也參與了病毒趨向和吸附宿主細胞過程[16]。最近，Matamoros 等[17]發現定位在ASFV 內膜、富含半胱氨酸多肽結構的pE199L 蛋白，雖與病毒的結合、內吞、裝配以及釋放無關，但在病毒與宿主細胞的膜融合以及病毒進入細胞核的過程中起著重要作用。

2）ASFV 復制與轉錄。與ASFV 的復制、修復和轉錄相關的蛋白大多是病毒自身合成的。參與DNA 復 制 的ASFV 蛋 白 有pF778R、pF334L、pF1055L、pG1211R、CP530、pK196R、pA104R、PCNA樣蛋白、泛素結合酶等。參與mRNA 轉錄的有RNA聚合酶類（pNP1450L、pEP1242L、pH359L、pD205R、pC147L 和pD339L 等），mRNA 修飾酶（甲基轉移酶pEP424R、加帽酶pNP868R 和多聚腺苷聚合酶pC475L 等）；轉錄因子pG1340L、解旋酶pD1133L 及含有解旋酶結構域的pQ706L 和pB962L 等也可能參與ASFV 轉錄過程。ASFV 擁有一套由DNA 連接酶pNP419L、DNA X 型聚合酶、pO174L 和II 類脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶pE296R等組成的堿基修復系統，該系統可以糾正巨噬細胞激活的氧化反應對病毒基因組造成的破損，保證病毒基因組的完整性[18]。ASFV 表達的復制高保真dUTP 酶pE165R 能夠在低dUTP 濃度下降低脫氧尿苷錯配的概率，保證堿基配對的準確性[19]。此外，拓撲異構酶Ⅱ還能夠應對雙螺旋結構在DNA 復制、轉錄和重組時遇到的拓撲問題。大量的研究表明MGF360 基因對病毒（不一定是ASFV）在巨噬細胞中的復制是至關重要的，但最近Ramirez 等[20]通過刪除ASFV-Georgia（ASFVG）的MGF360-1L 構建的重組病毒ASFV-G-Δ MGF360-1L，經體外體內感染實驗證明，MGF360-1L 對病毒毒力并不是必不可少的。同年，Ramirez等[21]又刪除ASFV-G 基因組中的X69R 基因構建了ASFV-G-ΔX69R 重組病毒，體內外實驗證明刪除X69R基因對病毒復制沒有顯著影響。

3）ASFV 組裝與釋放。pp220 和pp60 酶切產物以及pS273R 構成的病毒核心層外包裹p17、p54 和p72 等內膜蛋白組裝形成病毒粒子。成熟的病毒粒子依賴運動蛋白激酶和ASFV 衣殼蛋白，從病毒工廠運動到細胞膜，通過出芽的方式離開宿主細胞。

2.2 ASFV的免疫逃逸

ASFV 能夠表達多種免疫調節蛋白，抗衡宿主細胞的免疫系統和抗病毒機制，抑制宿主蛋白合成，誘導細胞凋亡，為病毒的繁殖和擴散提供有利條件。

1）ASFV 調控宿主細胞轉錄和翻譯。ASFV 能夠通過調節宿主細胞轉錄和翻譯達到抑制宿主的抗病毒免疫和促進自身蛋白表達的目的，參與此過程的蛋白主要有pA238L 和pDP71L 等。pA238L 是ASFV早期表達蛋白，包含與IκB類似的錨蛋白重復序列，是病毒在巨噬細胞中復制的非必需蛋白；AS?FV pA238L 能夠抑制轉錄因子NF-κB 與NFAT 的活化和促炎因子與免疫調控因子的分泌，還能下調iNOS 啟動子活性抑制抗病毒反應[22]。pDP71L 是AFSV 高度保守的晚期表達蛋白，位于ASFV 基因組的可變區；ASFV pDP71L 能夠招募蛋白磷酸酶1（protein phosphatase 1，PP1），促使真核翻譯因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）去磷酸化，從而促使病毒利用宿主表達系統大量合成所需蛋白；同時eIF2α 去磷酸化還能抑制peIF2α-ATF4-CHOP 信號通路的激活，抑制細胞凋亡，這有利于病毒的大量增殖[23]。

2）ASFV 調控宿主細胞信號通路。位于ASFV可變區的多基因家族主要包括MGF100、MGF110、MGF300、MGF360 和MGF505/530；其中MGF360 和MGF505/530 能夠抑制干擾素（interferon，IFN）和促炎因子的分泌，促使病毒的免疫逃逸[24]。MGF360家族成員pA276R 能夠抑制干擾素調節因子IRF3，進而抑制IFN-β 的 產 生；MGF505/530 家族成員pA538R 能夠同時抑制IRF3 和NF-κB，從而抑制IFN 的表達和JAK-ATAT 信號通路[25]。另外，ASFV編碼的其他蛋白也能夠通過抑制IFN 產生免疫逃逸。pI329L 是Toll 樣受體（toll-like receptors，TLRs）家族同源蛋白，是ASFV 感染晚期表達的跨膜蛋白；ASFV pI329L 能夠通過抑制TLR 下游接頭蛋白的活性，阻斷IRF3、NF-κB的活化和下游基因轉錄，從而抑制TLR3 介導的信號通路和IFN 的產生[25]。ASFV中國株pDP96R 也能抑制IFN 的產生和NF-κB 的活化[26]。

3）ASFV 調控宿主細胞凋亡。ASFV 在感染初期能夠抑制宿主細胞凋亡，有利于病毒的大量增殖；在感染后期促進宿主細胞凋亡，有利于病毒的釋放。ASFV 編碼的抑制凋亡的蛋白有pEP153R、pA224L、pA179L 和pDP71L，促進凋亡的蛋白主要有p54。ASFV pEP153R 是與C 型凝集素具有同源性的凝集素類蛋白，在病毒感染早期和晚期均有表達；pEP153R能夠下調MHC-Ⅰ的表達，抑制細胞凋亡，并參與病毒感染細胞和病毒與血細胞的吸附過程[16]。pA224L 在ASFV 感染晚期表達，在不同毒株中同源率在九成以上；ASFV pA224L 能夠通過抑制TNF-α 誘導的Caspase 3 的激活從而抑制細胞凋亡[16]。pA179L 屬于Bcl-2 家族，在ASFV 感染早期和晚期均有表達；Bcl-2 家族蛋白能夠調控細胞凋亡，由抑制細胞凋亡的Mcl-1、Bcl-2、Bcl-2、Bcl-XL等和促進細胞凋亡的Bad、Bak、Bax、Bid、bik 等組成；在多種細胞系中均證明ASFV pA179L 能夠與家族其他成員相互作用，抑制細胞凋亡[16]；此外，ASFV pA179L 能夠調節細胞自噬，抑制饑餓誘導的自噬[27]。p54是ASFV的結構蛋白，通過表達ASFV p54能夠誘導細胞凋亡。此外，ASFV 編碼的CD2v 具有抑制淋巴細胞增殖的功能[28]，ASFV L83L 能夠通過與IL-1β結合來破壞宿主先天免疫應答[29]。

各國科學家仍在不斷解析其他未知功能的蛋白。病毒蛋白p285L 和pK145R 的豐度高、但功能未知，直到2019年被指出p285L是病毒DNA復制之前就表達的基因早期產物，pK145R 則表達于晚期；預測膜蛋白p285L 能夠定位于純化過的病毒顆粒內，晚期蛋白pK145R 雖在病毒粒子里檢測不到，但卻能夠在感染的細胞中不斷積累，至于它們是否與病毒復制相關仍有待研究[30]。Ramirez 等[31]在2020年利用酵母雙雜交系統證明ASFV 的MGF360-16R基因編碼的轉錄晚期蛋白與SERTAD3 和SDCBP（參與核轉錄和宿主內病毒裝運的宿主蛋白）之間存在相互作用，但敲除MGF360-16R 構建的重組病毒ASFV-G-MGF360-16R，無論在體內外均表現出和親本ASFV-G 相似的毒力，說明MGF360-16R 基因與ASFV-G毒力無關。

3 ASFV疫苗

早在上世紀就有ASFV的報道，但由于ASFV龐大的基因組及其復雜的免疫逃逸機制，至今沒有研發出安全有效的疫苗。目前，ASF 相關疫苗主要包括滅活疫苗、減毒疫苗、亞單位疫苗、活載體疫苗和核酸疫苗等。

3.1 滅活疫苗

使用物理或化學的方法滅活變性ASFV，使其失去感染能力的同時保留免疫原性而制成ASF 滅活疫苗，這是一種傳統的疫苗制備方法。但迄今為止，各種滅活方式制備的ASFV 滅活苗均不能保護機體免受ASFV 強毒株的攻擊。Blome 等[32]利用二元乙炔亞胺（diacetylenimine，DEI）滅活病毒懸液得到的滅活苗，配以佐劑Polygen（TM）或Emulsigen（R）-D，免疫后能誘導機體產生抗ASFV 特異性抗體，但沒有產生針對同源毒株的攻毒保護作用，可能是因為產生的抗體不能與ASFV 發生中和反應。所以ASFV滅活疫苗還需要進一步研究。

3.2 弱毒疫苗

利用自然選擇或人工的手段可篩選出毒力弱化的病毒株，從而制備成ASF 弱毒疫苗。弱毒苗具有免疫原性良好，抗體持續周期較長等優點。目前，可將ASF 弱毒苗分為天然弱毒苗和人工弱毒苗。

自然界中存在毒力較弱的毒株，NH/P68 和OUR/T88/3 就是2 株ASFV 弱毒株。NH/P68 免疫后能夠增強豬自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）和細胞毒性淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）的活性，保護機體免受AFSV 強毒株L60 的攻擊[33]。OUR/T88/3 免疫后，能夠保護機體抵抗OUR/T88/1的攻擊，但這種保護作用會隨著CD8+T 淋巴的衰竭而減退[34]；后又發現用OUR/T88/3 首免，OUR/T88/1加強免疫的免疫方式免疫后的豬對強毒株Benin 97/1 和Uganda 1965 的攻擊具有保護作用，首次證明了誘導交叉免疫是可行的[35]。但天然弱毒苗仍具有傳染性和致病性，免疫動物常會出現高熱、關節腫脹等癥狀，還可能出現免疫力低的動物不耐受等[33,35]，這也是天然弱毒苗無法推廣的原因。

研究發現ASFV 能夠在豬源細胞系Vero、COS及MS等多種細胞傳代致弱。早在20世紀西班牙和葡萄牙學者就使用過傳代致弱的疫苗，結果發現免疫后的動物出現了不同程度的ASF 癥狀，大量動物死亡，存活下來的動物也攜帶大量的ASFV，說明連續傳代制備ASFV弱毒疫苗的方法還有待研究。

以上2 種弱毒苗均存在安全性問題，不能用于ASF的防治，隨著科學技術的不斷發展，學者們利用分子生物學手段對病毒的結構、毒力基因組成進行修飾，從而降低其毒力。相較于天然弱毒苗和傳代弱毒苗，重組弱毒苗更為安全，更加適合于大范圍使用。O'Donnell 等[36]利用基因工程手段敲除了AS?FV Georgia 2007（ASFV- G）的9GL（B119L）和UK（DP96R）基因，制備了雙基因敲除重組病毒AFSVG-Δ9GL/ΔUK；重組病毒經肌肉免疫豬后，結果顯示接種重組病毒的豬不會產生ASF 癥狀，并在接種后的2 周內能夠針對高毒力的ASFV Georgia 2007提供保護作用。Monteagudo 等[37]發現免疫CD2v（EP402R）基因缺失的BA71 株的AFSV，能夠保護豬免受BA71 攻擊的同時抵御異源病毒的攻擊，包括Georgia 2007/1。這些疫苗雖然有效，但安全性仍需要繼續增強。

2020年，Gladue 等[38]在缺 失了9GL 基因ASFV（ASFV-G-Δ9GL）的基礎上又刪除了2 個參與發病的基因（編碼CD2v和C型凝集素樣病毒基因），構建了2 種新的重組減毒活疫苗，即ASFV-G-Δ9GL/Δ CD2v 和ASFV-G-Δ9GL/ΔCD2v/ΔEP153R，結果顯示，ASFV-G-Δ9GL/ΔCD2v/ΔEP153R 能夠顯著降低ASFV的體外復制活性，但2種重組病毒并不能使家豬產生針對同源病毒株ASFV-Georgia 的攻毒保護作用。同年，Borca 等[39]將敲除了1177L 基因的AS?FV-G 經肌肉注射后發現，重組病毒能夠誘導強烈的病毒特異性抗體反應，感染豬發生了很低水平的病毒血癥；同時，ASFV-G-Δ117L 能保護機體免受ASFV-G 的攻擊，且在低劑量時仍能為機體提供保護。

3.3 亞單位疫苗

亞單位疫苗是通過ASFV 抗原蛋白誘導的特異性免疫反應保護機體免受病毒的攻擊，ASFV 編碼的蛋白種類繁多，常以組合抗原進行免疫，但目前還未發現特效的保護性抗原或抗原組合。表達重組ASFV p12 蛋白能夠抑制ASFV 與Vero 的結合[13]，ASFV p32、p54、p72 抗體能夠中和ASFV，抑制病毒吸附及內化[14]。Borca 等[39]利用人胚胎腎細胞293（human embryonic kidney cell 293，HEK293）表達的ASFV B646L（p72）、E183L（p54）和O61R（p12）以及MVA 載體 表達 的 抗原B646L、EP153R 和EP402R（CD2v），免疫豬后發現，HEK293制備的抗原蛋白能夠刺激機體產生體液免疫反應，但細胞免疫應答較弱；而MVA 載體抗原則能誘導細胞分泌IFN-γ。2020年的一項研究表明，將豬的免疫球蛋白IgG1或IgA1 Fc片段與ASFV 的p30或p54基因融合[40]，構建能夠表達融合蛋白p30-Fcγ和p54-Fcα的重組釀酒酵母，重組酵母免疫后能夠刺激家豬產生p30/p54特異性抗體和較高水平的黏膜免疫[41]。

3.4 病毒活載體疫苗

大量研究表明，在ASFV 的防治過程中，細胞免疫和體液免疫均扮演了重要角色[42-43]。Lokhandwala等[42]構建的能夠表達ASFV p32、p54、pp62 和p72 的重組腺病毒表達載體免疫后，能夠誘導機體產生的高水平的特異性體液、細胞免疫應答以及細胞毒性T 淋巴細胞反應；后又構建了表達A151R、B119L、B602L、EP402RΔPRR、B438L、K205R 和A104R 的重組腺病毒表達系統，并與佐劑混合免疫豬后發現，機體分泌了高水平的抗ASFV 特異性IgG 以及IFNγ[43]。雖病毒活載體ASFV 疫苗能夠同時誘導機體產生體液和細胞免疫應答，但仍需大量實驗證明疫苗的安全性和有效性。

3.5 核酸疫苗

核酸疫苗是選擇AFSV 保護性抗原基因，與表達載體連接構建能夠表達ASFV 抗原基因的重組表達質粒。Lacasta 等[44]構建了包含4 029 個克隆，大小約130 kb 的ASFV DNA文庫，覆蓋了76% 的Ba71V 株基因，用該文庫免疫豬后發現，約6 成的豬能夠抵御ASFV 強毒株E75 的攻擊，在存活豬中能夠檢測到CD8+T含量升高。核酸疫苗存在的問題也是無法提供對ASFV 全面的保護，所以尋找保護效果好的抗原或抗原組合仍是ASF防治的關鍵。

4 結 語

近年來，隨著對ASFV 編碼蛋白結構和功能研究的不斷深入，ASFV 的結構和感染過程逐漸清晰。但由于ASFV 基因組數量巨大，免疫逃逸機制復雜，病毒致病機理仍不清楚。目前，還沒有能夠直接消滅ASFV 的特效藥，所以除了加強動物飼養環境的消毒外，疫苗是阻斷病毒傳播的重要防治手段。目前，ASF滅活苗保護效果差，弱毒苗存在毒力返強和擴大病毒傳播等安全問題；所以亞單位疫苗、病毒活載體疫苗、核酸疫苗在ASF 防治過程中具有巨大的應用潛力，但現仍未開發出一款兼具安全和免疫效果好的疫苗。主要存在的問題就是ASFV 中具有良好免疫原性的保護性抗原或抗原組合仍未找到，所以還需進一步研究ASFV 的基因組，明確其編碼蛋白，理清其感染過程及傳播機制，以期為ASF 的防治提供理論依據。