黃連解毒湯對APP/PS1 小鼠海馬記憶功能的影響

李洋，徐加志，張英華，胡靈佳，賈翠翠，孫磊

（齊齊哈爾醫學院，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

0 引言

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種與老齡化密切相關的神經退行性疾病[1]。縱觀世界人口老齡化的發展趨勢，AD 現已成為嚴重的老年人疾病，僅次于腫瘤和心血管疾病，所以，預防和治療AD 的發生發展就成了目前關鍵的問題。β-淀粉樣蛋白（Amyloid beta，Aβ）沉積形成老年斑（Senile plaque，SP）是AD 主要病理特征之一，SP形成后會使神經突觸遭到破壞，喪失部分功能[2-3]。同時，有研究表示，AD 患者腦部突觸發生損害，會嚴重導致記憶的缺失[4]。在AD 疾病中，IL-1β 表達的增高與Aβ 沉積密切相關[5]。目前國內外對于治療AD 的方法有很多，但效果并不理想。祖國醫藥黃連解毒湯經過證實具有清熱、解毒、抗炎等功效[6-8]，因此，本研究通過觀察黃連解毒湯對APP/PS1 雙轉基因小鼠IL-1β 和TNF-α 表達的影響，探討HLJDT對AD 疾病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

5 月齡APP/PS1 雙轉基因小鼠，雄性，16 只，同窩同背景野生小鼠，雄性，8 只作為對照，均購自南京生物醫藥研究院，生產編號為：SCXK（蘇）2015-0001。由齊齊哈爾醫學院動物實驗中心飼養，本實驗獲得齊齊哈爾醫學院倫理委員會批準。

1.1.2 藥物制備及分組給藥

黃連解毒湯由黃連（9g）、黃芩（6g）、黃柏（6g）和梔子（9g）4 味組成，均購買于黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院。由醫藥科學研究院制成質量濃度為433g·kg-1的藥液備用。并將5 月齡APP/PS1 雙轉基因小鼠分為模型組和HLJDT組（433g·kg-1），每組8只。對照組為野生小鼠。對照組和模型組小鼠均給予等體積的生理鹽水（0.2mL·kg-1），連續灌胃35d。

1.1.3 儀器和試劑

Morris 水迷宮（上海移數信息技術公司，型號RD1101-MWM 型）；組織研磨器（北京天根，型號TGrinder）；小鼠IL-1β 和TNF-α 抗體（Abcam，貨號ab234473 和ab183218）。

1.2 方法

1.2.1 morris 水迷宮檢測

水迷宮是一個圓形水池，水池中心是透明厚板平臺，上方連接追蹤設備，池壁由紅、黃、藍、綠標記4 個象限。定位航行實驗：連續5d 對小鼠進行訓練，記錄小鼠的潛伏期，即60s 內找到平臺的時間；空間探索實驗：攝像機追蹤拍攝小鼠的運動軌跡，觀察軌跡的變化情況。

1.2.2 新物體識別實驗

實驗在一個黑色封閉箱中進行。適應期：連續3d 將小鼠放入封閉箱中，每次10min。熟悉期：在箱里邊緣對稱的位置放2 個體積大小都相同的紅色正方體木塊，并將小鼠放于箱內5min。測試期：30min 后，綠色圓柱形積木替換箱內其中一個積木塊，記錄5min 小鼠對綠色圓柱形積木即新穎事物(T novel，TN) 和紅色正方體即熟悉事物(T familiar，TF) 的探索行為，認知指數(recognition index，RI)=TN/ (TN+TF) ×100%。

1.2.3 RT-qPCR 檢測

50mg 組織中 加500μl Trizol，研磨勻漿，提取總RNA，再將RNA 反轉成cDNA，設計特異性引物：IL-1β 引物（F：5 ′ -GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3 ′；R：3 ′ -TGGATGCTCTCATCAGGACAG-5 ′），TNF-α 引物（F：5 ′ -CTGAACTTCGGGGTGATCGG-3 ′）GAPDH 引物（F：5 ′ -GAGACCTTCAACACCCCAGC-3 ′；R：3′-CCACAGGATTCCATACCCAA-5′），加SYBR Green I 熒光染料，結果采用2-ΔΔCt法計算。

1.3 觀察指標

1.3.1 潛伏期

潛伏期時間的長短代表著小鼠空間學習記憶能力的好壞，潛伏期短，預示著小鼠學習記憶能力好，反之，小鼠記憶能力減退。

1.3.2 運動軌跡

小鼠運動軌跡的不斷變化能夠清晰的看出學習記憶能力的改變。經過多次訓練的小鼠會很快搜索到平臺，表明學習記憶的提高；而記憶力差的小鼠則圍繞池壁來回搜尋，卻始終找不到平臺。

1.3.3 認知指數

觀察小鼠是否對新物品感興趣，若否，則認為小鼠有記憶缺失的可能。

1.3.4 IL-1β、TNF-α mRNA 的表達

觀察HLJDT 對IL-1β、TNF-α mRNA 表達的影響，判斷是否可通過調節促炎因子的表達使小鼠記憶能力得到改善。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 水迷宮檢測結果

2.1.1 對小鼠潛伏期的影響

與對照組進行比較，第1d 和第2d，模型組和HLJDT 組小鼠潛伏期無明顯變化（P>0.05）；第3d、4d、5d，模型組潛伏期明顯長于對照組（P<0.05）；與模型組比較，HLJDT 組小鼠潛伏期明顯縮短（P<0.05），見圖1。

圖1 訓練時三組小鼠的潛伏期

2.1.2 運行軌跡變化

對照組小鼠通過前5d 的訓練，可以在短時間內找到平臺；模型組小鼠只在池壁邊緣搜尋，且不能找到平臺；HLJDT 組雖圍繞池壁搜尋，但最終可以找到平臺，見圖2。

圖2 各組小鼠典型游泳軌跡

2.2 新物體識別實驗

與對照組比較，模型組小鼠RI 降低（P<0.05）；與模型組比較，HLJDT 組小鼠RI 明顯升高（P<0.05），見圖3。

圖3 各組小鼠的認知指數

2.3 RT-qPCR 檢測結果

與對照組比較，模型組小鼠IL-1β、TNF-α mRNA 水平均明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，HLJDT 組小鼠IL-1β、TNF-α mRNA 水平均明顯降低（P<0.05），見圖4。

圖4 RT-qPCR 檢測各組小鼠海馬區IL-1β、TNF-α mRNA 水平的比較

3 討論

AD 是一種隨著年紀增加而在老年時期表現為“癡呆”的疾病?！鞍V呆”與年齡有著密切的關系。經研究發現，多數老年人會在50 歲以后發病，60 歲以上的老年人發病率最高[9-10]。AD 主要表現為記憶力減退，伴有嚴重的認知障礙[11]，隨著病情的惡化，患者的生活能力會逐漸喪失，也會給家庭帶來沉重的負擔。

國內外研究學者對AD 疾病的預防和治療已經研究逾百年，提出了β-淀粉樣蛋白學說、膽堿能損傷學說等[12-13]，但都沒有明確AD 的發病機制。臨床上治療AD 的藥物也研發了多種，但藥物的顯著性尚不明了。炎癥因子學說的提出，為AD 的治療提出了新的研究方向，有研究顯示，神經炎癥的發生是由于腦組織中小膠質細胞的存在[14]，當AD 發生時，會有大量的Aβ 沉積，就會激活小膠質細胞釋放大量的促炎因子IL-1β 和TNF-α，嚴重影響疾病的治療[15-16]。

中醫認為治療AD 的主要環節應在“清熱解毒、化痰消炎”。黃連解毒湯是清熱解毒方的代表，在《肘后備急方》中首次記載了藥物組成[17]。此方由黃連、黃芩、黃柏、梔子四味中藥按3 ∶2 ∶2 ∶3的比例配伍而成，經研究表明，其具有抗炎、抗菌、抗氧化、清熱解毒的功效，在臨床應用中常被用于治療AD、帕金森、癲癇等神經系統疾病。

本研究Morris 水迷宮結果表明，模型組潛伏期有所增加，長于對照組，而HLJDT 組潛伏期從第3天開始逐漸縮短，小鼠反應不再遲鈍；通過觀察小鼠運動軌跡我們發現，模型組小鼠的學習記憶能力較差，只圍繞池壁來回搜尋，而HLJDT 組小鼠則能夠找到平臺，顯著提高了學習記憶能力。新物體識別實驗中，模型組小鼠認知指數降低，而HLJDT 組小鼠認知指數明顯升高，說明HLJDT 能改善APP/PS1小鼠的學習和空間記憶能力，使“癡呆”樣癥狀得到緩解。

綜上所述，RT-qPCR 檢測結果顯示，HLJDT 可降低APP/PS1 小鼠海馬區IL-1β 和TNF-α mRNA 的表達，對神經炎癥的發展起到了保護作用。因此，本研究得出，HLJDT 可通過調節促炎因子的釋放來發揮對AD 的保護作用，這也為AD 疾病的治療提供新的研究思路。