納米銀對人骨髓間充質干細胞增殖和凋亡的影響

趙忠福，李曉光，鄒德勛，孫蘭春，姚宏波

（1.齊齊哈爾醫學院附屬第二醫院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫學院組織胚胎學教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006）

0 引言

骨關節假體、支架材料等植入物感染給患者帶來嚴重后果[1]。細菌耐藥性持續加劇，生物材料感染率日趨增高[2]。納米銀（Silver nanoparticles，AgNP）能夠釋放Ag2+，抑制微生物或抑制能量傳遞[3]，具有抑制細菌、真菌和病毒等活性[4]，被應用于生物材料、醫用材料涂層等領域[5]。以AgNPZnO 復合物在骨科植入物表面涂層，能夠有效降低感染，擴大了骨科器械的應用，促進了醫療技術的進步[6]。骨髓內含有大量骨髓間充質干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC），BMSC 能夠分化為骨或軟骨，促進骨組織修復和骨折愈合[7]。體外實驗發現，BMSC 中添加AgNP，可以促進BMSC成骨分化[8]。雖然AgNP 對BMSC 具有促進分化，抑制細胞感染的作用，但是AgNP 對BMSCs 增殖或凋亡是否產生影響，還鮮見報道。闡明AgNP 對BMSC 增殖、凋亡的影響效果，能夠為納米銀在臨床應用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料

hBMSCs 購自美國ATCC 公司。α-MEM 培養基、胎牛血清購自Hyclone 公司；直徑10nm 銀納米溶液、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）均購自Sigma 公司；CCK-8 試劑購自日本同仁公司；Triciribine（Akt 抑制劑）購自美國Selleck 公司；RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒等Western blot 試劑購自上海碧云天生物科技有限公司；人Total-SOD 和MDA 的ELISA 試劑盒均購自美國R&D 公司；小鼠抗人Caspase 3 抗體、小鼠抗人GAPDH 抗體和辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗小鼠IgG 購自英國Abcam 公司。美國Molecular 公司的Spectra Max190 酶標儀；美國BD 公司的FACSAria Ⅱ流式細胞儀；日本Olympus 公司的IX53 型倒置熒光顯微鏡。上海天能科技公司的Tanon 6200 發光成像分析系統。

1.2 方法

1.2.1 BMSC 培養及實驗分組

本實驗得到齊齊哈爾醫學院附屬第二醫院醫學倫理委員會審核并批準。BMSC 用含10%胎牛血清的α-MEM 培養基進行培養。正常培養條件下，無任何刺激培養的BMSCs 為對照組，以5μmol/L AgNP 刺激BMSC 則為AgNP 組；若同時以5nmol/L Triciribine和5μmol/L AgNP 培養的BMSCs 則為Akt 抑制劑組。

1.2.2 CCK-8 實驗

1.0×104BMSCs/孔，加入96 孔細胞培養板每孔中，37℃，5%CO2培養12h 后，每孔再添加10μL CCK-8 試劑，繼續培養4h。Spectra Max190 酶標儀在450nm 波長檢測各組BMSC 的吸光度值（Absorbance value，A 值）。

1.2.3 Western blot

6.5×106各組BMSCs 用RIPA 裂解液裂解。4℃，12000r/min 離心5min，40μg 各組BMSCs 蛋白，100V，經SDS-PAGE 電泳90min，轉至PVDF 膜；5%脫脂奶粉封閉60min；分別加入小鼠抗人Caspase 3抗體（1:300），小鼠抗人GAPDH 抗體（1:500），4℃孵育18h；加入HRP 標記山羊抗小鼠IgG（1:400），室溫孵4h；ECL 發光劑標記蛋白條帶，Tanon 6200發光成像分析系統顯影，IPP6.0.1 軟件分析蛋白條帶的相對表達情況。

1.2.4 酶聯免疫吸附實驗（ELISA）

6.5×106各組BMSCs 用RIPA 裂解液裂解。4℃，10000r/min 離心5min，取上清液，人ELISA 試劑盒檢測各組BMSCs 的Total-SOD、MDA 蛋白的含量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 AgNP 對BMSCs 增殖的影響

對照組、AgNP 組、Akt 抑制劑組BMSCs 的A 值分別為（1.68±0.81）、（2.94±0.13）、（1.71±0.44），三組比較，差異有統計學意義（P<0.01）。AgNP組BMSCs 的A 值是對照組的1.75 倍（P<0.01），Akt 抑制劑組BMSCs 增殖A 值是AgNP 組的58.16%（P<0.01）。

2.2 AgNP 抑制Caspase 3 蛋白表達

對照組、AgNP 組、Akt 抑制劑組BMSCs 的Caspase 3 相對表達量分別為（0.89±0.07）、（0.43±0.01）、（1.01±0.20），組間比較，差異有統計學意義（P<0.01），AgNP 組Caspase 3 蛋白相對表達量是對照組的48.33%（P<0.01）。Akt抑制劑組Caspase 3 相對表達量是AgNP 組的2.34倍（P<0.05），見圖1。

圖1 Western blot 檢測各組BMSCs 的Caspase 3 蛋白表達條帶

2.3 AgNP 對Total-SOD、MDA 蛋白的影響

對照組、AgNP 組、Akt 抑制劑組BMSCs 的Total-SOD、MDA 比較，差異有統計學意義（P<0.01）。AgNP 組BMSC 的Total-SOD、MDA 分別是對照組的1.57 倍、77.20%（P<0.01）；Akt 抑制劑組Total-SOD、MDA分別是AgNP組的65.38%、1.24倍（P<0.01），見表1。

表1 各組BMSCs 的Total-SOD 和MDA 表達（，n=18）

表1 各組BMSCs 的Total-SOD 和MDA 表達（，n=18）

注：*P<0.01，與對照組比較；#P<0.01，與AgNP 組比較

3 討論

研究發現，顆粒直徑10nm 的AgNP 能夠形成較大表面積，有利于釋放Ag2+，因此，AgNP 比Ag2+具有更顯著的殺菌或抑菌效果[9]。AgNP 在醫療植入物表面形成抗微生物涂層，能夠有效防止形成微生物膜[10]。抗微生物植入材料具有出色的生物相容性是臨床應用，減少副作用，避免感染的基本前提。為了模擬體內炎癥環境，我們利用CCK-8 實驗觀察對照組、AgNP 組和Akt 抑制劑組BMSCs 的增殖情況，相對于對照組，AgNP 組的BMSCs 的A 值增高，提示AgNP 促進BMSC 增殖能力。這可能由于AgNP 具有較好的抗氧化、抑菌等能力，提高了細胞表達抗氧化酶[11]，但是相關實驗還需要深入驗證。AgNP 組Caspase 3 蛋白表達降低也驗證AgNP 對BMSC 具有抗氧化，抑制自由基損傷功能[12]。為了驗證我們的判斷，以ELISA 實驗證明了AgNP 組Total-SOD 蛋白高表達，Total-SOD 有效抵抗缺氧、炎癥等原因產生的自由基[13]，修復受損的細胞膜脂質或細胞內DNA 分子，降低細胞內過氧化氫含量，達到抗自由基逆轉組織損傷的效果[14]。此外，研究認為，細胞凋亡時，丙二醛（MDA）由細胞膜脂質雙層的內側外翻，是衡量細胞應激嚴重程度，細胞受到嚴重損傷的重要指標之一[15]。本實驗的ELISA 實驗發現：與對照組相比，AgNP 組MDA 表達水平下降，表明AgNP 在抗自由基損傷中起著重要作用。Akt 抑制劑組Total-SOD 含量降低，MDA 表達升高的結果，提示AgNP 能夠通過激活Akt 信號通路上調Total-SOD 表達。也有研究揭示AgNP 通過Akt-AMPK-mTOR 途徑誘導HC11 細胞產生保護性自噬氧化應激和線粒體膜電位改變，與細胞氧化應激和線粒體改變有關[16]。當然，我們并不否定AgNP 除了Akt 途徑外，AgNP 也可能激活Erk[17]、MAPK[18]等信號通路發揮作用，關于AgNP 對細胞的分子機制還需要在今后的細胞水平和動物水平進行深入研究。

綜上所述，納米銀通過Akt 通路促進表達Total-SOD，提高BMSCs 增殖，抑制其凋亡。在后續實驗中，我們將利用炎癥、缺氧等細胞模型，深入揭示納米銀對間充質干細胞增殖、分化等影響和分子機制，以便為納米銀的基礎研究和臨床應用奠定研究基礎。