TSPAN13在乳腺癌組織中的表達及與臨床病理特征的關系

周蓓 樊利春 吳沉昊 王婧

乳腺癌具有異質性，治療方案因人而異。手術、靶向藥物有了很大發展，但治療效果仍不明顯。TSPAN13(又稱NET-6)屬于四肽超家族，染色體位于7p21.1，TSPAN13基因編碼含204個氨基酸的蛋白質，參與了一系列的生物學過程，包括分化、凋亡、增殖和轉移等[1]。Iwai等[2]研究發現，乳腺癌細胞株細胞中TSPAN13低表達，是乳腺癌的抑癌基因。我們采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR)及Western blot法檢測了乳腺癌組織中TSPAN13表達，分析TSPAN13表達水平與臨床病理特征的關系。

對象和方法

一、對象

2017年1月～2019年1月我院接受乳腺癌根治手術治療的乳腺癌病人96例。納入標準：(1)女性，均明確診斷為乳腺癌；(2)術前未行放化療、內分泌治療等；(3)臨床資料完整；(4)簽訂知情同意書，并上報醫院倫理道德委員會批準。排除標準：合并其他器官腫瘤；嚴重精神疾病；合并嚴重的心、肝、腎疾病。96例相應的癌旁正常乳腺組織(距癌灶>5 cm)作為正常組。10例良性病變組織(纖維腺瘤)作為對照。96例乳腺癌病人一般資料見表1。

表1 病人基線資料

二、方法

1.qRT-PCR法檢測組織中TSPAN13 mRNA表達水平：超聲粉碎組織，PBS溶液洗滌溶解，加入等體積TRIzol試劑。根據試劑盒說明書提取總RNA，溶于20 μl DEPC水，取1 μl加入79 μl DEPC水測OD260/OD280檢測純度。根據反轉錄試劑盒(武漢博士德公司)合成cDNA，樣品總RNA 1 μg，隨機引物或oligo-dT(18-20) 100 pmol，脫氧核苷三磷酸(每種dNTP各10 mmol/L) 1 μl，反轉錄緩沖液(5×) 4 μl，RNase抑制劑(20～40 U/μl ) 1 μl，M-MLV反轉錄酶20 U，DEPC處理水補至20 μl，目標引物序列由北京華大基因生物有限公司合成(表2)。根據試劑盒說明書進行PCR擴增：cDNA 2 μl、上下引物各3 μl、Taq聚合酶0.5 μl，總體積共25 μl，反應參數設置為92 ℃ 20 s、96 ℃ 2 s、85 ℃ 20 s、80 ℃ 6 s，共40個循環。構建溶解曲線，2-△△Ct法表示目標引物mRNA的相對表達量。

表2 引物序列

2.Western blot法檢測組織中TSPAN13蛋白表達水平：無菌條件下取組織，加2 m1 RIPA組織裂解液，充分混合，冰浴30分鐘，40 ℃ 1 000 r/min離心15分鐘，去上清，超聲波破核，離心，留上清進行檢測。配膠，上樣，電泳，轉膜，切膜，封閉液封閉1小時，逐次大鼠抗人TSPAN13(1∶100，Santa Cruz，美國)、β-actin單克隆抗體(1∶50，Santa Cruz，美國)、辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶100，Santa Cruz，美國)。Bio-Rad成像儀曝光成像，Image Lab Software測定光密度，以TSPAN13與β-actin條帶比值表示相對表達量。

三、 統計學方法

結果

1.乳腺癌組織、癌旁組織及乳腺良性腫瘤組織中TSPAN13 mRNA表達：乳腺癌組織中TSPAN13 mRNA表達水平(0.25±0.04)低于癌旁組(0.52±0.08)、乳腺良性腫瘤(0.48±0.05)差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：與乳腺癌組織比較，aP<0.001

2.乳腺癌組織、癌旁組織及乳腺良性腫瘤組織中TSPAN13蛋白表達：乳腺癌組織中TSPAN13蛋白水平(0.31±0.04)低于癌旁組織(0.57±0.07)、乳腺良性腫瘤(0.56±0.02)，差異具有統計學意義(t=31.598，30.984，P=0.000，0.000)，見圖2。

A:Western Blot檢測結果；B:各組TSPAN13蛋白相對水平統計學分析。與乳腺癌組織比較，aP<0.001

3.乳腺癌組織TSPAN13 mRNA表達水平與臨床病理特征的相關性：高、中分化乳腺癌組織中TSPAN13表達量高于低分化，無遠處轉移乳腺癌組織中TSPAN13表達量高于有轉移乳腺癌組織，I+Ⅱ期乳腺癌組織中TSPAN13表達量高于Ⅲ期乳腺癌組織，HER2(-)乳腺癌組織中TSPAN13表達量高于HER2(+)乳腺癌組織，ER(-)、PR(-)乳腺癌組織中TSPAN13表達量低于ER(+)、PR(+)乳腺癌組織，Ki-67指數<14%乳腺癌組織中TSPAN13表達量低于Ki-67指數≥14%乳腺癌組織(P=0.001，0.001，0.001，0.000，0.004，0.000)。在年齡、部位、腫瘤直徑、HER2+ER+PR狀態組中表達無差異(P>0.05)。見表3。

表3 乳腺癌組織TSPAN13蛋白表達水平與臨床病理特征的相關性(例)

討論

乳腺癌病理分型差異較大，容易出現遠處轉移。隨著蛋白組學和基因組學的開展，通過檢測相關生物蛋白標志物，有助于預測預后，制定有針對性的個體化治療方案[3]。目前已經篩選出了一系列腫瘤標志物，如催乳素(PRL)、血管內皮生長因子(VEGF)等[4]，但尚無一種敏感度高的標志物。

TSPANl3是一種跨膜蛋白，在膜蛋白構建和細胞信號傳導中發揮重要作用。TSPANl3基因位于染色體7p21.1，TSPANl3基因的缺失與腎母細胞瘤的發生有關[5]。Yan等[6]篩選前列腺癌候選基因時發現，TSPANl3與S100A9比值可用于前列腺癌的早期診斷。Wang等[7]利用生存分析數據庫對TSPANl3與乳腺癌病人預后的關系進行了檢索、分析，結果顯示，乳腺癌組織低表達TSPANl3病人生存時間比高表達病人短。

Huang等[8]研究發現，下調TSPAN13可增強乳腺癌細胞的侵襲、增殖能力。我們采用qRT-PCR、Western blot法檢測了乳腺癌組織中TSPAN13基因、蛋白的表達，結果顯示，乳腺癌組織中TSPAN13 mRNA及蛋白表達水平均低于正常乳腺組織及乳腺良性腫瘤組織。乳腺浸潤性癌是最常見的病理分型，特征為細胞浸潤乳腺導管的基底層并侵入間質，乳腺浸潤性癌中TSPAN13表達水平低于非浸潤癌。本研究結果顯示，低分化、有遠處轉移、Ⅲ期乳腺癌組織TSPAN13低表達，提示TSPAN13可能與乳腺癌的侵襲能力有關。

乳腺癌是一類分子水平具有高度異質性的腫瘤，以分子分型差異為依據對乳腺癌進行分子分型對乳腺癌的個性化治療意義重大。近年來，乳腺癌分子分型的研究已經從高分子水平深入到基因水平，相關的因子包括ER、PR、HER2、Ki-67蛋白表達等，這些生物學指標與腫瘤的侵襲、轉移、復發及預后密切相關[9]。

Ki-67是一種與細胞周期相關的蛋白質，與惡性腫瘤的進展、轉移、復發及預后密切相關[10-11]。Zhang等[12]研究顯示，乳腺癌組織中Ki-67高表達，Ki-67表達百分比與增殖程度和轉移相關。Ki-67被認為是乳腺癌獨立預后指標，是LuminalA和B型分類的關鍵指標。Cheng等[13]確定以Ki-67指數14%作為預后好、壞的分界。本研究結果顯示，Ki-67指數≥14%乳腺癌組織中TSPAN13低表達，提示TSPAN13可能與乳腺癌的轉移、預后有關。

ER是存在于乳腺上皮細胞上的一種蛋白質，能與雌激素結合形成復合體，進入細胞核發揮作用[14]。PR是ER作用于染色體后形成的一種蛋白質，可調節乳腺上皮細胞的增殖，PR的合成受ER的調控[15]。ER、PR水平與乳腺癌病人總生存(OS)、無病生存(DFS)、無復發生存(RFS)及5年生存率等呈正相關[16]。本研究結果顯示，ER、PR陽性乳腺癌組織中TSPAN13高表達，提示TSPAN13參與了乳腺癌細胞的增殖、分裂等，低表達與乳腺癌預后不良有關。

HER2又稱為c-erbB-2基因，編碼跨膜受體蛋白，參與細胞生長、分化的信號傳導。研究表明，HER2具有抑制細胞凋亡，促進增殖，促進腫瘤血管、淋巴管生成，增強細胞侵襲能力等功能[17]。HER2是評價乳腺癌預后、藥物治療效果的指標之一。研究表明，HER2表達水平與OS、DFS呈負相關。本研究結果顯示，HER2陽性乳腺癌組織中TSPAN13低表達，提示TSPAN13可能與乳腺癌預后、臨床療效有關[18]。

本研究入選的樣本量較少，有待進一步增加樣本量，多中心的研究證實。本次研究未進行相關的生存分析，是我們下一步研究的重點之一。