lncRNA SNHG16通過靶向miR-22-3p調控腎母細胞瘤WIT49細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的分子機制

倪志福 汪曉玲 屈振繁 孫恒 王波

腎母細胞瘤是臨床常見的一種惡性腫瘤，其常發生于兒童時期，近年來，我國腎母細胞瘤發病率逐年上升，已嚴重威脅患兒生命安全，目前臨床主要根據病理類型評估腎母細胞瘤患兒的預后，但其具有極大的局限性，腎母細胞瘤發病機制尚未闡明，因而探究腎母細胞瘤發生及發展的分子機制對提高其診斷效率及評估患兒預后均具有重要意義[1]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)在腎母細胞瘤中表達上調或下調，并可調控細胞增殖、凋亡等生物學過程，還可能作為腎母細胞瘤靶向治療的潛在靶標[2-4]。長鏈非編碼RNA SNHG16(lncRNA SNHG16)在腎母細胞瘤中表達水平升高，并可調控miR-200a-3p的表達從而促進腎母細胞瘤發生及發展[5]。靶基因預測顯示微小RNA-22-3p(miR-22-3p)與SNHG16存在結合位點，研究表明miR-22-3p在腎母細胞瘤中表達水平降低，并可通過靶向AKT3的表達從而調控細胞增殖及侵襲[6]。但SNHG16是否可通過調控miR-22-3p參與腎母細胞瘤發生及發展過程尚未可知。因此，本研究主要探討SNHG16與miR-22-3p對腎母細胞瘤WIT49細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響及其可能作用機制，為腎母細胞瘤分子治療提供潛在靶點。

對象與方法

一、對象

選取2017年10月～2019年3月本院收治的腎母細胞瘤患兒30例，所有患兒均被確診為腎母細胞瘤，其中男20例，女10例，年齡1～10歲，平均年齡(4.26±1.23)歲，術中切除腎母細胞瘤組織及癌旁組織，置于-80 ℃超低溫冰箱內保存。本研究經本院倫理委員會批準，患兒家屬知情且簽署同意書。

人腎母細胞瘤WIT49細胞購自美國ATCC細胞庫；DMEM培養液、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司；Lipofectamine2000購自北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑、SuperScriptTMIV One-Step RT-PCR System with ezDNaseTM、SuperScriptTMIII PlatinumTMSYBRTMGreen One-Step qRT-PCR Kit購自美國Thermo Fisher公司；CCK-8試劑購自上海李記生物科技有限公司；si-NC、si-SNHG16、miR-NC、miR-22-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-22-3p購自上海吉瑪制藥技術有限公司；pcDNA3.1、pcDNA-SNHG16購自美國Invitrogen公司；Transwell小室購自北京優尼康生物科技有限公司；Matrigel基質膠購自北京綠源伯德生物科技有限公司；Annexin V-FITC / PI凋亡試劑盒購自北京博爾邁生物技術有限公司；兔抗人CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、p21、Bax抗體購自美國Santa Cruz公司；HRP標記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

二、方法

1.實驗分組：WIT49細胞接種于96孔板(1×103個/孔)，分別將si-NC、si-SNHG16、miR-NC、miR-22-3p mmics、si-SNHG16與anti-miR-NC、si-SNHG16與anti-miR-22-3p轉染至WIT49細胞，分別記作si-NC組、si-SNHG16組、miR-NC組、miR-22-3p組、si-SNHG16+anti-miR-NC組、si-SNHG16+anti-miR-22-3p組。

2.qRT-PCR檢測SNHG16、miR-22-3p的表達水平：采用Trizol法提取癌旁組織、腎母細胞瘤組織及各組WIT49細胞總RNA，將總RNA反轉錄合成cDNA(按照試劑盒說明書操作)，以cDNA為模板進行qRT-PCR反應(按照試劑盒說明書進行操作)，應用ABI 7500型熒光定量PCR儀檢測SNHG16、miR-22-3p相對表達量。

3.CCK-8法檢測細胞增殖：取各組WIT49細胞接種于96孔板(1×103個/孔)，分別于培養24小時、48小時、72小時時加入CCK-8溶液(10 μl/孔)，繼續孵育2小時，應用酶標儀檢測各孔吸光度值(OD值)。

4.Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲：取各組細胞懸液(2.5×104個/ml)加入小室的上室(200 μl/孔)，將含有10%胎牛血清的培養液加入小室的下室(600 μl/孔)，繼續培養24小時，分別使用多聚甲醛固定及結晶紫染色后置于顯微鏡下觀察遷移細胞數。實驗前在小室的上室加入Matrigel基質膠稀釋液(40 μl/孔)，繼續孵育4小時，按照細胞遷移實驗步驟進行后續實驗，置于顯微鏡下觀察侵襲細胞數。

5.流式細胞術檢測細胞凋亡率：取各組WIT49細胞加入PBS洗滌，棄上清，向細胞沉淀中加入Binding Buffer懸浮細胞(500 μl)，參照凋亡試劑盒說明書分別加入Annexin V-FITC(5 μl)與PI(5 μl)，充分混勻，室溫避光孵育10 min，應用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

6.雙熒光素酶報告基因檢測SNHG16、miR-22-3p的靶向關系：LncBase Predicted v.2預測顯示SNHG16、miR-22-3p存在結合位點，分別構建野生型載體WT-SNHG16與突變型載體MUT-SNHG16，分別將miR-NC、miR-22-3p mimics與WT-SNHG16、MUT-SNHG16共轉染至WIT49細胞，繼續培養24小時，檢測各組細胞熒光素酶活性。

7.Western blot檢測CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、p21、Bax蛋白表達：WIT49細胞加入RIPA裂解液(400 μl)提取細胞總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度，取蛋白樣品(50 μg)進行SDS-PAGE電泳反應，轉膜、封閉(2小時)，分別孵育一抗稀釋液(1∶1 000)與二抗稀釋液(1∶2 000)，室溫孵育1小時，滴加ECL，暗室內曝光顯影，應用自動凝膠成像系統分析各蛋白條帶。

三、統計學處理

結果

1.lncRNA SNHG16和miR-22-3p在腎母細胞瘤組織中的表達：與癌旁組織比較，腎母細胞瘤組織中SNHG16的表達水平顯著升高(P<0.05)，miR-22-3p的表達水平顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 lncRNA SNHG16和miR-22-3p在腎母細胞瘤組織中的表達

2.抑制lncRNA SNHG16表達對腎母細胞瘤WIT49細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響：與si-NC組比較，si-SNHG16組OD值顯著降低(P<0.05)，遷移及侵襲細胞數顯著減少(P<0.05)，凋亡率顯著升高(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)，p21、Bax蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見表2、表3、圖1。

表2 抑制lncRNA SNHG16表達對腎母細胞瘤WIT49細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響

表3 抑制lncRNA SNHG16表達對腎母細胞瘤WIT49細胞增殖、遷移侵襲和凋亡相關蛋白的影響

圖1 增殖、遷移侵襲和凋亡相關蛋白的表達

3.lncRNA SNHG16靶向調控miR-22-3p的表達：LncBase Predicted v.2預測顯示SNHG16與miR-22-3p存在結合位點，見圖2。miR-22-3p過表達可明顯降低野生型載體WT-SNHG16的熒光素酶活性(P<0.05)，而對突變型載體MUT-SNHG16熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)，見表4。與pcDNA組比較，pcDNA-SNHG16組miR-22-3p的表達水平顯著降低(P<0.05)；與si-NC組比較，si-SNHG16組miR-22-3p的表達水平顯著升高(P<0.05)，見表5。

圖2 SNHG16的序列中含有與miR-22-3p互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶實驗

表5 lncRNA SNHG16調控miR-22-3p表達

4.miR-22-3p過表達對腎母細胞瘤WIT49細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響：與miR-NC組比較，miR-22-3p組OD值顯著降低(P<0.05)，遷移及侵襲細胞數顯著減少(P<0.05)，凋亡率顯著升高(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)，p21、Bax蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見表6、表7、圖3。

表6 miR-22-3p過表達對腎母細胞瘤WIT49細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響

表7 miR-22-3p過表達對腎母細胞瘤WIT49細胞增殖、遷移侵襲和凋亡相關蛋白表達的影響

圖3 增殖、遷移侵襲和凋亡相關蛋白表達

5.下調miR-22-3p表達逆轉了抑制lncRNA SNHG16表達對腎母細胞瘤WIT49細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的作用：與si-SNHG16+anti-miR-NC組比較，si-SNHG16+anti-miR-22-3p組OD值顯著升高(P<0.05)，遷移及侵襲細胞數顯著增多(P<0.05)，凋亡率顯著降低(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)，p21、Bax蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見表8、表9、圖4。

圖4 增殖、遷移侵襲和凋亡相關蛋白表達

表8 下調miR-22-3p表達逆轉了抑制lncRNA SNHG16表達對腎母細胞瘤WIT49細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的作用

表9 下調miR-22-3p表達逆轉了抑制lncRNA SNHG16表達對腎母細胞瘤WIT49細胞增殖、遷移侵襲和凋亡相關蛋白表達的作用

討論

腎母細胞瘤患兒臨床表現為腫瘤包塊破潰引起的血尿及腹部疼痛，其治療效果已取得巨大進步，但其已給患兒家庭造成一定負擔，lncRNA表達異常可調控腎母細胞瘤細胞增殖、凋亡等生物學過程，Zhu等[7]研究表明LINC00473可充當miR-195的海綿分子而調控腎母細胞瘤發生及發展過程。lncRNA可充當miRNA的海綿分子而參與腎母細胞瘤發生及發展過程[8-10]。但lncRNA在腎母細胞瘤形成及發展過程中的作用機制尚未完全闡明。

SNHG16在喉鱗狀細胞癌中的表達水平升高，并可通過介導miR-877-5p / FOXP4軸促進喉鱗狀細胞癌的發展[11]。敲低SNHG16可通過充當miR-342-3p的海綿分子而抑制多發性骨髓瘤細胞增殖[12]。SNHG16通過下調DKK3的表達促進胃癌上皮-間質轉化[13]。本研究結果顯示，腎母細胞瘤組織中SNHG16的表達水平明顯升高，進一步研究顯示抑制SNHG16表達可明顯降低OD值及CyclinD1蛋白水平，提高p21蛋白水平。研究表明CyclinD1可正向調控細胞周期促進細胞增殖，p21可負向調控細胞周期抑制細胞增殖[14]。本研究結果進一步證實抑制SNHG16表達可抑制腎母細胞瘤細胞增殖。細胞轉移能力增強與腫瘤進展密切相關，MMP-2、MMP-9屬于基質金屬蛋白酶，其可通過降解細胞外基質沉積從而促進細胞遷移及侵襲[15]。本研究結果顯示抑制SNHG16表達可明顯減少遷移及侵襲細胞數，降低MMP-2、MMP-9的表達水平，提示抑制SNHG16表達可抑制腎母細胞瘤細胞遷移及侵襲。細胞增殖與凋亡異?？纱龠M腫瘤發生及發展，Bcl-2表達下調可抑制細胞凋亡，Bax表達上調可促進細胞凋亡[16]。本研究結果顯示抑制SNHG16表達可提高凋亡率，促進Bax表達及抑制Bcl-2表達，提示抑制SNHG16表達可促進腎母細胞瘤細胞凋亡。

本研究證實SNHG16可靶向結合miR-22-3p，并可負向調控miR-22-3p的表達及活性。 LINC00858通過充當miR-22-3p的ceRNA而促進細胞增殖、遷移和侵襲[17]。lncRNA NNT-AS1通過調節miR-22-3p / YAP1軸促進非小細胞肺癌的進展[18]。lncRNA DGCR5通過抑制miR-22-3p而促進肺腺癌進程[19]。miR-22-3p靶向α-烯醇酶1調節視網膜母細胞瘤細胞的增殖[20]。本研究結果顯示腎母細胞瘤組織中miR-22-3p的表達水平降低，miR-22-3p過表達可抑制腎母細胞瘤細胞增殖、遷移及侵襲，促進細胞凋亡，提示miR-22-3p在腎母細胞瘤發生及發展過程中可發揮重要調控作用。同時本研究將si-SNHG16與anti-miR-22-3p共轉染至腎母細胞瘤細胞，結果顯示細胞增殖、遷移及侵襲能力明顯增強，凋亡率明顯降低，提示下調miR-22-3p表達可明顯逆轉抑制SNHG16表達對腎母細胞瘤細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的作用。

綜上所述，抑制SNHG16表達可通過上調miR-22-3p的表達從而抑制腎母細胞瘤細胞增殖、遷移及侵襲，促進細胞凋亡，可為揭示腎母細胞瘤發病機制奠定實驗基礎，還可能作為腎母細胞瘤靶向治療的潛在靶點。但關于其作用機制尚需進一步探究。