復合酶協同超聲輔助提取東北土當歸葉中總黃酮及其抑菌活性的研究

吳淑清，艾叢蘋，欒茗然，朱文秀

(1.長春大學 食品科學與工程學院，吉林 長春 130022；2.浙江李子園食品股份有限公司，浙江 金華 321000)

東北土當歸，學名長白楤木，又稱草本刺嫩芽、狗苦龍芽等[1]，營養物質極為豐富，既是山野菜，又是中草藥。古醫書記載其根可入藥，具有祛風燥濕、解熱鎮痛、疏風活血和利尿解毒等功效[2]。東北土當歸中黃酮類化合物和苷類化合物具有較強的抗氧化活性[3]，貝殼烯酸、貝殼杉醇酸、海松酸等二萜成分具有鎮靜作用[4]。此外，其葉中含有的某些成分具有降血壓、降血糖、抗炎鎮痛、預防心腦血管疾病、延緩衰老和保護神經系統等功效[5]。

復合酶協同超聲波提取東北土當歸葉中總黃酮的原理是，酶可破壞植物組織細胞，使細胞壁破裂，從而降低與溶劑之間的傳質阻力[6]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東北土當歸：由長春大學園林學院王曉紅教授的實驗種植基地提供；蘆丁標準品：國藥集團化學試劑有限公司；纖維素酶(400 U/mg)、果膠酶(50000 U/g)：美國sigma公司；無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉：天津市福晨化學試劑廠，均為分析純；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉：北京奧博星生物技術有限責任公司。

供試菌種：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，均為長春大學實驗室留存菌種。

1.2 儀器與設備

WJX-A1000型高速多功能粉碎機：上海緣沃工貿有限公司；超聲波清洗器：深圳市潔盟清洗設備有限公司；721型可見分光光度計：日本島津儀器有限公司；TDL-50B低速離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 東北土當歸葉預處理

將新鮮東北土當歸葉清洗干凈，自然曬干后，置于粉碎機中粉碎，再過40目(0.425 mm)篩，裝入密封袋，冷藏保存備用。

1.3.2 總黃酮提取工藝流程

東北土當歸葉總黃酮提取工藝流程見圖1。

圖1 東北土當歸葉總黃酮提取工藝流程

1.3.3 標準曲線的制作

將蘆丁標準品經110 ℃干燥至恒重，冷卻至室溫備用。稱取蘆丁標準品10 mg，用30%乙醇于50 mL容量瓶中定容，超聲溶解5 min，可得濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標準品溶液，冷藏保存備用。分別吸取蘆丁標準品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL的比色管中，各加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL、10%硝酸鋁溶液1 mL、1 mol/L氫氧化鈉10 mL，最后用50%乙醇定容至刻度線，搖勻，放置10 min，于510 nm處測定吸光度[7]，繪制標準曲線。得到回歸方程：y=10.232x+0.0049(R2=0.9992)，式中，y為吸光度，x為蘆丁質量濃度(mg/mL)。結果表明，蘆丁標準品溶液濃度為0.01～0.05 mg/mL時，與吸光度呈良好的線性關系。

1.3.4 東北土當歸葉總黃酮的測定

吸取5 mL樣液于25 mL容量瓶中，其他操作按照制作標準曲線的方法處理。計算東北土當歸葉中總黃酮含量，公式如下：

式中，T：總黃酮物質的含量，mg/g；C：總黃酮質量濃度，mg/mL；V：總黃酮提取液體積，mL；m：樣品質量，g；n：稀釋倍數。

1.3.5 單因素實驗和正交試驗

采用復合酶協同超聲波提取法從東北土當歸葉中提取總黃酮，以總黃酮提取量作為衡量標準，確定各因素的最適范圍。單因素實驗因素水平見表1。

表1 單因素實驗因素水平

在單因素實驗的基礎上，設計L9(34)正交試驗，以確定總黃酮的最佳提取工藝。正交試驗因素水平見表2。

表2 正交試驗因素水平

1.3.6 總黃酮提取液的抑菌試驗

吸取0.1 mL無菌水，將菌液稀釋為0.5個麥氏比濁度的菌懸液，再用移液槍吸取100 μL稀釋菌液滴加在平板上，用涂布棒將菌液均勻涂布在滅菌平板上。用無水乙醇將總黃酮提取液分別稀釋成不同濃度，將滅菌后的濾紙片浸泡在提取液中1 h，于紫外燈下照射20 min。用無菌鑷子夾取濾紙片，3片一組等間距放在培養基上。用浸有無菌水的濾紙片做對照，于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，取出后觀察是否有透明圈[8]。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 復合酶比例對總黃酮提取量的影響

由圖2可知，當復合酶(纖維素酶/果膠酶)比例為1∶2時，總黃酮提取量達到最大值。纖維素酶占比的增加能更好地破壞東北土當歸葉的細胞壁，使得細胞中的總黃酮物質更好地溶出；但纖維素酶占比過高時，底物濃度不能使復合酶達到飽和狀態，復合酶的作用會受到抑制，進而導致總黃酮提取量降低[9]。

圖2 復合酶比例對總黃酮提取量的影響

2.1.2 料液比對總黃酮提取量的影響

由圖3可知，當料液比為1∶40(g/mL)時，總黃酮提取量達到最大值。但隨著溶劑量的增加，一方面總黃酮類物質的溶出量有限；另一方面溶劑過多會導致其他雜質的大量溶出，而有些雜質與總黃酮類物質之間存在拮抗作用，會影響提取效果[10]。

圖3 料液比對總黃酮提取量的影響

2.1.3 乙醇濃度對總黃酮提取量的影響

由圖4可知，當乙醇濃度為40%時，總黃酮提取量達到最大值。根據相似相溶的原理，極性越接近，溶解度越大。當乙醇濃度為40%時，溶劑的極性和黃酮的極性最為接近，黃酮溶解度最大[11]。

圖4 乙醇濃度對總黃酮提取量的影響

2.1.4 超聲溫度對總黃酮提取量的影響

由圖5可知，當超聲溫度為50 ℃時，總黃酮提取量達到最大值。適當升高溫度有利于總黃酮類物質的溶出；但過高的溫度會導致總黃酮類物質氧化和降解，使提取量下降[12]。

圖5 超聲溫度對總黃酮提取量的影響

2.2 正交試驗結果

在單因素實驗的基礎上進行正交試驗，試驗結果見表3。

表3 正交試驗結果

由表3可知，影響總黃酮提取量的四個因素的主次順序為乙醇濃度>料液比>復合酶比例>超聲溫度，最佳提取工藝條件為A3B1C3D2，即復合酶比例2∶1、料液比1∶30(g/mL)、乙醇濃度50%、超聲溫度50 ℃。

2.3 驗證實驗

對正交試驗得到的最佳工藝條件進行驗證實驗。經過三次平行實驗，實際測得總黃酮提取量為12.6 mg/g，與預測值相近，說明工藝優化得到的技術參數是穩定可靠的。

2.4 抑菌試驗結果

由表4可知：當稀釋濃度倍數高于1/4時，兩種細菌均有透明抑菌圈，表明總黃酮提取液對兩種細菌均有不同程度的抑制作用；當稀釋濃度倍數為1/4時，金黃色葡萄球菌周圍幾乎沒有抑菌圈，隨著總黃酮濃度的降低，抑菌圈也減小至無；當稀釋濃度倍數為1/8時，沒有抑菌效果。由以上結果可以得出，對金黃色葡萄球菌的抑菌濃度為0.5 mg/mL，對大腸桿菌的抑菌濃度為0.25 mg/mL。

表4 總黃酮提取液抑菌試驗結果

3 結論

本研究以東北土當歸葉為原料，以乙醇溶液為溶劑，采用復合酶(纖維素酶/果膠酶)協同超聲波提取東北土當歸葉中總黃酮。通過單因素實驗和正交試驗，確定最佳提取工藝：復合酶比例2∶1、料液比1∶30 (g/mL)、乙醇濃度50%、超聲溫度50 ℃。在此條件下，總黃酮提取量達到最大值，為12.6 mg/g。通過抑菌試驗證明東北土當歸葉總黃酮有良好的抑菌作用，對金黃色葡萄球菌的抑菌濃度為0.5 mg/mL，對大腸桿菌的抑菌濃度為0.25 mg/mL。