抗菌肽的研究進展

姜雯雯

近些年來，抗生素的廣泛使用導致細菌耐藥性增強以及藥物殘留的問題日益凸顯，而抗菌肽具有廣譜抗菌、無免疫原性、殺菌速度快等特點，可以作為一種新型抗菌藥物而具有廣泛的應用前景[1]。抗菌肽，又稱宿主防御肽，被認為是先天免疫的重要組成部分，廣泛存在于真菌、細菌、動物和植物中，不僅可以直接影響微生物，還可以提高淋巴細胞、巨噬細胞等免疫細胞水平進而增強機體的免疫反應。自20世紀80年代Hultmark在惜古比天蠶中分離并命名為天蠶素以來，至今為止在細菌、真菌、動物、植物中已發現了2000多種具備抗菌活性的抗菌肽。

1 抗菌肽的分類

1.1 植物抗菌肽

最早在植物中發現的抗菌肽是硫素（thionin），之后又從植物的花、葉、果中發現了其它類別的抗菌肽如：植物防御素（plant defensins）、橡膠蛋白、打結素類（knottin-like peptides）、酯轉移蛋白酶（lipid trans?fer proteins）、蛻皮素（snakins）和環肽類（Cyclotides）等[2]。其中，硫素、酯轉移蛋白酶、植物防御素在植物抗病工程中得以應用，部分植物抗菌肽和特性見表1。在應用方面，國內開發了一些可以表達不同含量植物抗菌肽的轉基因植物，對植物疾病有著不同抗性，可以用作保護植物的一種方式，但植物抗菌肽生產成本高等技術問題尚未能解決，所以無法用于商業化量產。植物抗菌肽在畜牧領域可以作為飼料改善牲畜胃腸道功能，在食品領域可以作為天然防腐劑。

表1 植物抗菌肽的特點及分布

1.2 昆蟲抗菌肽

昆蟲類抗菌肽提取自昆蟲，現今已有200多種抗菌肽在昆蟲體內被發現常見的如蜜蜂、甲蟲、天蠶、果蠅等。它的產生是由于昆蟲受到感染或刺激時由昆蟲血淋巴產生的一種多肽物質，具有抗菌廣、不破壞正常細胞等優點，此類抗菌肽在完全變態和不完全變態昆蟲體內的產生方式不同，在前者體內是由上皮細胞和脂肪體迅速合成然后釋放到血淋巴中，在后者體內是先在健康昆蟲體內血細胞中合成，受到感染或刺激后才釋放到血淋巴中。根據這些多肽的抗菌功能和氨基酸排列順序主要分為五類：富含甘氨酸的抗菌肽、富含脯氨酸的抗菌肽、昆蟲防御素、天蠶素類抗菌肽（見表2）。

表2 部分昆蟲抗菌肽來源和結構特點

昆蟲抗菌肽在醫藥、農業、食品貯藏等方面都有研究，目前昆蟲抗菌肽中的尼生素是唯一一個被批準運用于食品防腐的抗菌肽[3]。昆蟲的免疫機制在某些方面與人類免疫機制相似，進一步了解昆蟲的免疫機制為炎癥性、感染性疾病的預防和治療提供參考[4]。

1.3 哺乳動物抗菌肽

哺乳動物抗菌肽主要存在于哺乳動物的白細胞、皮膚和黏膜的上皮細胞中。此類抗菌肽研究最多的是防御素類抗菌肽，哺乳動物防御素(defensins)有α- defensins 和β- defensins 兩種類型。Defensins能夠迅速的作用于病毒和細菌的細胞膜，通過穿膜機制起到抗菌、抗病毒的作用，而且還能參與機體的免疫調節，例如富集炎性細胞和促進炎性因子產生等作用。自發現以來，已從豬、兔、牛、馬均提取出了高活性的抗菌肽，如1980年Leherer從兔肺的巨噬細胞中發現了一種富含半胱氨酸Cys 殘基的防御素；1989年Lee 從豬小腸中分離提取出抗菌肽cecropin P1；1991年Diamond G從牛的氣管黏膜上皮細胞中發現了TAP。目前，在人體內只發現了一種名為LL-37的cathelicidin內源性抗菌多肽，分子量為18ku，含37個氨基酸，不僅能夠參與免疫反應，還能幫助血管生成和促進傷口愈合[5]。

表3 魚類和兩棲動物類抗菌肽功能比較

1.4 魚類和兩棲動物類抗菌肽

目前已報道的魚類抗菌肽大多存在于表皮黏液中，還有部分存在于其他組織器官中，如鐵調素（hep?cidins）、內源性抗菌肽（cathelicidins）、肝表達抗菌肽2 抗體（LAEP-2）等，研究表明魚類抗菌肽具有一些獨特屬性，如在較高鹽濃度下仍具有生物活性。魚類抗菌肽目前已從各種魚類動物（虹鱒、河鱒、大鱗大馬哈魚等）中提取出來。兩棲動物種類繁多，在中國大陸的兩棲動物約2/3的兩棲動物是中國特有種，且同一物種皮膚分泌物的種類也有所不同，如抗菌肽、抗癌肽、速激肽、緩激肽促胰島素釋放肽等等一系列生物活性肽。最具有代表性的兩棲動物要屬蛙類，蛙類的皮膚為它們的生長發育提供了先天條件。由于蛙類皮膚濕潤而且暴露于空氣中，正好適宜病原體生長繁殖，為抵抗這些病原體的侵害，表皮腺體會分泌一系列抗菌肽。蛙類抗菌肽在抗腫瘤、抗病毒活性方面均有研究，例如從中國大蹼鈴蟾皮膚提取的Maximin 3 抗菌肽能夠抑制HIV 感染T 細胞，從歐洲林蛙皮膚分泌物提取出的Temporin L 能誘導腫瘤細胞死亡。

1.5 細菌抗菌肽

細菌抗菌肽根據其合成途徑可分為兩種：一種是核糖體合成抗菌肽；另一種是非核糖體合成抗菌肽，即通過非核糖體多肽合成酶基因控制來合成，統稱為抗菌脂肽[6]。目前在細菌中發現的抗菌肽有：乳酸球菌素（Nisin）、多粘菌素E（PolymyxinE）、桿菌肽（Bacitracin）、短桿菌肽S（GramicidinS）等，其中，乳酸球菌素（Nisin）研究最多，由乳酸菌產生，僅限于對革蘭氏陽性菌起作用，而對革蘭氏陰性菌無效。還有乳酸菌產生的乳鏈球菌素lacticin 3147，被用于食品保藏。細菌抗菌肽與來自動物的抗菌肽有所不同，細菌抗菌肽具有一定的毒性，而且效力比較高，在納摩爾濃度可抑制細菌甚至殺死細菌，這也是它們能占據生態位的一個重要原因。

2 抗菌肽的應用

如今，抗菌藥物的種類越來越多，細菌的耐藥性也隨之加強，抗菌肽的發現使得這個局面變得好轉。抗菌肽不僅能抗菌，而且還能抗病毒、抗腫瘤。目前已知的抗菌肽多達2500 余種，部分抗菌肽在臨床研究表現出功效良好且具有低副作用的特點，如抗菌肽MU1140和菌絲霉素等，還有部分抗菌肽已經進入臨床試驗[7]。此外，抗菌肽還可以運用在食品保鮮方面和畜牧養殖方面。

2.1 食品保鮮中的應用

食品加工中難免會加入化學防腐劑以確保食品新鮮，但化學防腐劑不易被人體吸收且加熱后容易變性，對人體有一定危害。抗菌肽進入人體后可以被蛋白酶水解，而且食品加熱也不容易使抗菌肽變性[8]。有實踐證明在動物日糧中添加抗菌肽后，不僅可以改善其腸道功能，而且還能提高動物抵抗力，對動物的生長性能也有利，國內外許多企業已經研發成功[9]。有研究表明，鮮牛乳中加入乳酸菌素后不僅可以延長貨架期還可以保留原有風味，再結合巴氏滅菌，保留時間將更長。將某些抗菌肽如：細菌素、尼生素、植物防御素等添加到食品包裝上可以達到保鮮、防腐效果。

2.2 畜牧養殖中的應用

在畜牧養殖中，傳統方法是在飼料中添加抗生素，容易破壞腸道微生物并且容易殘留，嚴重影響人的身體健康和產品質量[10]。隨著對抗菌肽了解更加深入，眾多研究表明抗菌肽添加到飼料中可以增強動物免疫力，降低患病率，提高生產質量。李生濤[11]在喂養母豬的飼料中加入抗菌肽，降低了弱仔率而且還減少了母豬流產；覃志彪[12]等人在蝦苗的基礎餌料中加入抗菌肽，通過五組不同濃度的實驗對比，發現蝦的體長增長率、成活率、增重率有提高。

3 抗菌肽制備方法

國內外制備食源性肽的方法主要有酶解法、化學合成法、基因工程法及微生物發酵法等。多種方法的組合或者單獨使用都廣泛地應用于生物活性肽的分離制備中，不同方法適合不同目的，各有其優缺點。基因工程雖然成本低還能大量獲取抗菌肽，但得到的抗菌肽抑菌活性會比天然抗菌肽低[13]；除化學合成和基因工程，其它方法均需要大量原材料，需要從生物中提取，利用微生物蛋白酶反應發酵是用來產生生物活性肽和食源性蛋白質的一種有效方法。某些特定的菌類群，能夠化合生物體的蛋白質以及氮元素，提取出的酶化物以及維生素等物質可以直接抑制病原菌，降解難分解的物質，極易被植物體吸收，增強其防病害的功能。目前國內外研究較多的為乳蛋白與大豆蛋白，可從中分離出多種活性多肽[14]，張志焱[15]等對一株產抗菌肽枯草芽孢桿菌BL0006的發酵培養基和發酵條件進行優化，提高發酵液中抗菌肽的效價。

酶水解法是產生活性肽的主要方式，具有較低成本、反應極易控制、不易出現意外以及能夠定位生產等諸多相關的優點，可以很好地滿足產品需求。酶水解法最重要的則是蛋白酶的選用，需要定點酶切，還要符合食品安全。一些常見的酶，例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶等既能單獨使用，又可以組合產生更多穩定、高效的生物活性肽。如Pellegrini等[16]使用胰蛋白酶水解牛乳β-乳球蛋白，獲得四種具有抑菌活性的肽段。顧晨濤[17]等用胃蛋白酶解等工藝得到具有較強抑菌活性的鯽魚魚鱗抗菌多肽，Zeineb等[18]利用駝乳蛋白酶水解產物進行了抑菌試驗，結果表明駱駝初乳的抗菌活性高于牛乳，且經過與未處理原乳的對比實驗得出蛋白酶解后釋放出更多具有抗菌活性的肽。劉云姣[19]等人通過響應面法優化南極磷蝦蛋白酶解工藝研究表明：胰蛋白酶為最適蛋白酶，最佳條件是在44.48℃溫度下，PH為7.88，酶解時間8.52h，這項研究的結果帶來了很好的啟示——可以從南極磷蝦中提取抗菌肽且資源豐富。

4 展望

無論是原核生物還是真核生物，體內多多少少存在具有防御作用的抗菌肽，它們抗病毒、細菌、真菌且不易引起微生物耐受的特點引起了廣大科學家的注意，也因此有了很廣闊的應用前景。抗菌肽雖然可以借助基因重組技術或化學合成的方法來降低成本，但對其生產出的抗菌肽作用穩定性、藥效學、藥動學以及毒副作用還未能清楚[20]。且應用于牲畜的食品添加劑以及美容業的抗菌肽生產成本高、對真核細胞的毒性作用、體內代謝過程、體內代謝對機體的影響等問題都亟待需相應方法來解決，就生產成本而言，目前大多是應用基因工程來提高生產率從而降低生產成本，還可在分離純化環節入手來提高生產效率。總之，在科學的前進道路上，發現問題進而解決問題，將現存問題解決之后，方能造福人類。