帶有納米溝槽的靜電紡微米纖維支架對促進細胞滲透生長的研究

鄭 毅 黃 晨

東華大學紡織學院，上海201620

靜電紡納米纖維具有的柔軟及比表面積大等特性與天然細胞外基質(ECM)相似，可以促進細胞的生長和增殖，所以被廣泛用作組織修復和再生的支架材料。該類支架材料中的納米多孔結構不僅有助于營養和廢物的交換，還可以作為屏障，阻礙外部病原體的入侵[1-2]。

細胞在三維浸潤生長的過程中，其形態和功能類似于體內的細胞，這有利于組織的修復和再生。傳統靜電紡膜的二維致密堆積結構會嚴重阻礙細胞的三維浸潤生長。三維多孔支架能為細胞的滲透生長提供條件，故越來越多的學者開始制備三維支架并應用于組織工程中。通常，制備三維靜電紡支架的方法有犧牲模板法[3-7]、雙組分彎曲法[8]、離子鹽法(如利用離子鹽添加劑[9]，帶有離子鹽的收集器[10]等)、機械鉆孔和氣體發泡結合法[11]等。這些方法制得的三維支架孔徑大，細胞滲透性改善，但制備工藝復雜，生產不穩定，形成的多孔結構也不穩定，故實際應用受限。

文獻[12]提到，增大纖維直徑，則靜電紡纖維支架的孔徑也隨之增大。為實現細胞在支架上的三維浸潤生長，最直接易行的方法就是增大纖維直徑，但簡單地增大纖維直徑可能使支架失去仿生特性。

本文將使用雙溶劑法制備表面具有納米溝槽紋理結構的微米級左旋聚乳酸(PLLA)纖維支架。該支架具有大的纖維間孔和高度定向的表面凹槽，允許人體成纖維細胞(HFF)三維滲透生長，可更好地應用于組織和器官的修復。

1 試驗準備

1.1 原料與試劑

原料：PLLA，平均摩爾質量為190 000 g/mol，濟南岱罡生物工程有限公司; 二氯甲烷(DCM)，分析純，上海凌峰化學試劑有限公司；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，分析純，上海凌峰化學試劑有限公司； HFF，中國科學院細胞庫； CCK-8試劑盒,日本同仁化學公司；戊二醛，質量濃度為25 g/L，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器

S4800型場發射掃描電子顯微鏡(FE-SEM),日本日立公司；CPF-1100AI型毛細管流動孔隙率測定儀，美國PMI公司；WDW-20型醫用紡織品多功能強力儀，上海華龍測試儀器有限公司；ASAP 2460型多站擴展式全自動快速比表面與孔隙度分析儀，美國Micromeritics公司；Synergy H4光譜光度酶標儀，美國Bio-tek公司。

1.3 支架的制備

稱取一定量的PLLA溶于DCM和DMF的混合溶劑中，分別制備3種質量濃度(100、130和230 g/L)的PLLA溶液。3種PLLA溶液采用不同混合比例的溶劑制備，其中：100 g/L PLLA溶液中VDCM∶VDMF=2∶1，130 g/L PLLA溶液中VDCM∶VDMF=3∶1，230 g/L PLLA溶液中VDCM∶VDMF=4∶1。3種PLLA溶液均攪拌24 h后靜置備用。

對上述所得均勻溶液進行靜電紡絲，其紡絲工藝條件：電壓為15 kV，針頭到接收板距離為20 cm，對應于100、130和230 g/L PLLA溶液的紡絲速度分別為1、3和2 mL/h，針頭為21 G，溫度為25 ℃，環境相對濕度為45%，控制總擠出量為5 mL。

100、130和230 g/L PLLA溶液制得的支架試樣依次編號為1#、2#和3#。

1.4 細胞培養與種植

將HFF細胞培養在含有10%(質量分數)胎牛血清的高糖DMEM培養基中，并一起放入溫度為37 ℃、含CO2(體積分數為5%)的培養箱中，每隔3 d更換培養基。當細胞融合度達到85%時加入適量胰酶進行消化，離心后以1∶3的比例傳代，重懸于高糖DMEM培養基中。本文試驗所用的HFF細胞為第12～20代細胞。

將3種PLLA纖維支架試樣裁剪成直徑為14 mm的圓形，放入24孔板內，在紫外燈下照射30 min滅菌，之后將細胞以每孔1×104的密度種植在PLLA纖維支架試樣上。

2 性能測試

2.1 支架性能測試

2.1.1 表觀形態

對PLLA纖維支架試樣分別進行噴金處理，采用FE-SEM觀察試樣的表觀形態，并根據所得的SEM圖像，使用Image J軟件對纖維直徑進行測量。

2.1.2 孔徑

將PLLA纖維支架試樣裁剪成3 cm×3 cm的大小，放入孔徑儀的專屬油劑中充分浸潤，然后使用毛細管流動孔隙率測定儀測定試樣的孔徑和孔徑分布。

2.1.3 拉伸性能

根據 GB/T 6672—2001《塑料薄膜和薄片 厚度測定 機械測量法》和 GB/T 1040．3—2006《塑料拉伸性能的測定 第3部分：薄塑和薄片的試驗條件》，將PLLA纖維支架試樣裁剪成10 cm×1 cm的長條狀，使用醫用紡織品多功能強力儀，設定拉伸速度為10 mm/min，測定試樣的應力和應變。

2.1.4 BET比表面積

使用多站擴展式全自動快速比表面與孔隙度分析儀測定PLLA纖維支架試樣的比表面積。

2.2 體外生物試驗

2.2.1 細胞形態

HFF細胞接種到PLLA纖維支架試樣上24 h后，加入質量濃度為25 g/L的戊二醛進行固定，再用梯度酒精脫水2次，之后在CO2臨界干燥點干燥，噴金后用FE-SEM觀察細胞形態。

2.2.2 細胞增殖測試

細胞種植到PLLA纖維支架試樣上后，培養1、3和7 d，并于每個時間點將180 μL培養液和20 μL CCK-8試劑加入到每個孔中，在37 ℃下孵育4 h后從 24 孔培養板的每個孔中取出100 μL反應液轉移到干凈的96孔板內，利用光譜光度酶標儀測定溶液在450 nm處的吸光度。

2.2.3 細胞滲透生長測試

采用Transwell試驗評估細胞浸潤性。將具有PLLA纖維支架的Transwell半透膜置于24孔板中，在24孔板底部放置hFDM生長因子以誘導細胞進行滲透生長。將總數為1×105的HFF細胞接種在Transwell半透膜的PLLA纖維支架(厚度均為300.00 μm) 上，細胞遷移72 h后移除PLLA纖維支架，用體積分數為4%的福爾馬林固定滲透Transwell半透膜的細胞，并用結晶紫溶液對細胞進行染色。使用光學顯微鏡對結果進行拍攝，Image J軟件量化滲透的細胞占據的面積百分比。通過比較每組滲透過Transwell半透膜的細胞所占據的面積比，判斷細胞滲透生長的水平。

3 結果與討論

3.1 支架性能

3.1.1 纖維形態與直徑分布

3種質量濃度的PLLA溶液制得的1#、2#和3#支架試樣的SEM照片及計算得到的直徑分布見圖1。

從圖1a)和b)可以看出：所有PLLA纖維的直徑都比較均勻，且隨著紡絲液濃度的提高，靜電紡纖維的直徑也隨之增大，3#支架試樣中PLLA纖維直徑最大；1#支架試樣中PLLA纖維表面最為光滑，2#和3#支架試樣中PLLA纖維的表面呈現出明顯的平行溝槽結構。

從圖1c)可以看出：1#支架試樣中PLLA纖維平均直徑為0.81 μm，標準偏差0.13 μm；2#支架試樣中PLLA纖維平均直徑為1.06 μm，標準偏差0.21 μm；3#支架試樣，即當紡絲液質量濃度達到230 g/L時，PLLA纖維平均直徑增大到3.01 μm，標準偏差0.46 μm。

圖1 PLLA纖維的SEM照片及其直徑分布

產生溝槽的原因實際上是一個相分離的過程，原理見圖2，主要是因為DCM和DMF兩種溶劑的沸點差距較大所致。

圖2 納米溝槽形成原理

紡絲過程中，納米溝槽的形成分三步：

第一步，DCM會率先從射流中揮發，吸熱導致空氣中的水氣凝結在纖維表面，產生相分離；

第二步，水氣和殘留的DCM被靜電場拉伸后進一步揮發，在纖維上留下孔洞，此時噴出的紡絲液依舊保持流動性；

第三步，隨著紡絲過程的進行，孔洞在電場的作用下被逐漸拉伸、結合，形成平行溝槽。

3.1.2 孔徑

圖3是3種PLLA纖維支架試樣孔徑的測試結果。從圖3可以看出：本試驗制得的靜電紡PLLA纖維支架試樣的孔徑是不均勻的，孔徑大體呈正態分布；PLLA纖維支架的孔徑大小與纖維直徑呈正相關，纖維直徑越大，支架的平均孔徑也越大。1#試樣和2#試樣中PLLA纖維直徑相差不大，兩者的平均孔徑相差也不大，分別為2.81 μm和3.13 μm；3#試樣的PLLA纖維平均直徑在3.01 μm，平均孔徑達到12.42 μm。

圖3 PLLA纖維支架試樣的孔徑分布

3.1.3 拉伸性能

圖4是3種PLLA纖維支架試樣的拉伸性能測試結果。從圖4可以看出，隨著纖維直徑的增大，支架試樣的力學性能反而下降。這是因為纖維直徑增大，支架的孔徑也隨之增大，纖維與纖維之間的纏結點變少，故導致其力學性能降低。

圖4 PLLA纖維支架試樣的應力-應變曲線

3.1.4 BET比表面積

由于纖維直徑約為3.00 μm的光滑靜電紡膜難以制備，故本試驗選擇與2#試樣纖維直徑接近的聚氨酯(PU)靜電紡膜作為參考進行測試，PU纖維的平均直徑為1.14 μm，標準偏差為0.15 μm。表1是3種PLLA纖維支架試樣和PU靜電紡膜的BET比表面積(SBET)測試結果。

表1 PLLA纖維支架試樣和PU靜電紡膜的BET比表面積測試結果

由表1可以看出：隨著纖維直徑的增加，PLLA纖維支架的BET比表面積下降，這與以往的研究結果一致；PU靜電紡膜的BET比表面積甚至小于3#試樣的BET比表面積，可以推斷，在纖維直徑相近的情況下，溝槽結構的存在可以增加支架的BET比表面積。

3.2 體外生物試驗

3.2.1 細胞形態

圖5是細胞的SEM照片。根據以往的研究，細胞更容易黏附在表面粗糙的支架上[13]。從圖5可以看出，1#試樣的細胞黏附效果最佳，2#和3#試樣上也有細胞黏附，故可以推測該結果系與纖維表面溝槽的存在使得支架的BET比表面積增大有關；從細胞在3#試樣上的生長情況不難看出，細胞有沿著纖維生長的趨勢，說明平行溝槽會誘導細胞的生長行為。

圖5 細胞生長的SEM照片

3.2.2 CCK-8細胞增殖試驗

CCK-8細胞增殖試驗結果見圖6，圖中“*”表示該試樣與1#試樣相比p<0.05，具有顯著性。

圖6 CCK-8細胞增殖試驗結果

從圖6可以看出：盡管1#和2#試樣的直徑、孔徑相差不大，但2#試樣上培養的細胞增殖情況略優于1#試樣，這與2#試樣上的溝槽結構有利于細胞發生增殖和遷移有關；3#試樣上培養的細胞增殖情況優于2#試樣，可見除去纖維的表面形態外，支架的孔徑大小也會影響細胞的增殖情況，且孔徑越大，細胞的增殖情況越好，該結果和以往的研究結果基本一致[14]。

3.2.3 細胞滲透生長

圖7是Transwell試驗裝置示意。

圖7 Transwell試驗裝置示意

圖8是用光學顯微鏡拍攝的Transwell試驗結果。

圖8 Transwell 試驗結果

圖8中，大量被染成紫色的細胞出現在視野范圍內，且HFF細胞在3#試樣上的滲透情況比在1#和2#試樣上的多很多。這說明3種試樣在厚度相同的情況下，3#試樣因具有最大的孔徑而細胞更易滲透支架。

圖9對Transwell試驗結果進行了量化分析。其中“*”和“#”表示該試樣分別與1#和2#試樣比較時p<0.05，具有顯著性。

圖9 Transwell 試驗結果量化分析

從圖9可以看出，細胞滲透1#、2#和3#試樣占據視野范圍內的面積比例分別為0.77%、2.27%和12.09%， 這非常直觀地表明了細胞在大孔徑的3#試樣上滲透效果最好，有效地實現了細胞的三維滲透生長。

4 結論

采用靜電紡絲技術，在沒有額外處理的情況下，通過控制紡絲液濃度和溶劑種類，一步制備了同時具備納米和微米結構優勢的靜電紡PLLA纖維支架。纖維表面的納米溝槽結構對細胞的黏附和增殖情況有積極影響，還能引導細胞沿著溝槽方向生長。紡絲液濃度的提高可使纖維直徑增大。當PLLA質量濃度達到230 g/L時，纖維的平均直徑增大到3.00 μm以上，支架的平均孔徑擴大到12.00 μm以上，細胞能夠通過支架內部相通的孔道進行滲透生長，且其三維滲透生長的效果遠優于傳統的二維靜電紡膜。本研究制備的靜電紡微米纖維支架更有利于細胞的三維滲透生長，以及組織和器官的形成，未來有望應用于創傷修復、生物反應器及骨修復等領域。