新疆某地區(qū)犬流感病毒血清學(xué)及病原學(xué)調(diào)查

米曉云，盛肖剛，吳建勇，汪萍，楊學(xué)云，魏玉榮*

（1新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆 烏魯木齊，830013）

（2新疆動(dòng)物疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830013）

（3新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆 烏魯木齊830011）

犬流感（canine Influenza，CI）是一種由犬流感病毒（Canine Influenza Virus，CIV）引起的急性接觸性呼吸道傳染病。犬是流感病毒生態(tài)循環(huán)中的重要中間宿主，馬流感病毒（H3N8亞型）、禽流感病毒（H3N2亞型、H5N1亞型、H5N2亞型和H10N8亞型）和人流感病毒（H1N1亞型）等均可感染犬[1-6]。犬H3N2亞型流感毒株2006年由中國(guó)分離并報(bào)道，其基因序列與韓國(guó)水鳥的禽源H3N2基因序列高度同源[7-8]。隨后研究報(bào)道，犬H3N2亞型流感在中國(guó)、韓國(guó)、泰國(guó)及美國(guó)等地流行[9-12]。盡管目前尚未有CIV跨種感染人的報(bào)道，但犬的流感病毒中間宿主作用和“病毒混合容器”角色，注定無(wú)法忽視它在流感病毒生態(tài)循環(huán)中的重要作用，及其對(duì)人類公共衛(wèi)生安全造成潛在的威脅。為了解烏魯木齊地區(qū)流浪犬和寵物犬群體中流感現(xiàn)狀，評(píng)估其對(duì)公共衛(wèi)生危害性，本研究對(duì)部分流浪犬和寵物犬進(jìn)行了犬流感病毒血清學(xué)和病原學(xué)調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 被檢樣本

流浪犬基地流浪犬血清樣本和鼻拭子樣本各100份采集于2019年1月；寵物店就診寵物犬血清樣本150份和鼻拭子樣本79份收集于2019年1月至2019年9月。鼻拭子樣本放置于含500 μL PBS緩沖液（pH 7.2）的2 mL離心管中。所有被檢樣本-20℃保存?zhèn)溆茫y(tǒng)一檢測(cè)。

1.2 主要試劑

DL 2000 DNA Marker和TakaRa PrimeScriptTM One Stemp RT-PCR Kit Ver.2購(gòu)自購(gòu)自 TakaRa；ID Sreen?influenza A Antibody Comptition Multi-species試劑盒購(gòu)自ID VET；TIANamp Virus RNA Kit購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 引物

根據(jù)NY/T-772-2013合成流感檢測(cè)通用引物M229[13]，根據(jù)文獻(xiàn)合成擴(kuò)增 CIV 檢測(cè)引物 cH3N2-602F和cH3N2-1145R[14]。參照GenBank序列（登錄號(hào)：MK212413、MK212411）設(shè)計(jì)HA和NA基因引物，見表1。引物由新疆昆泰銳生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物序列

1.4 CIV血清學(xué)檢測(cè)

-20℃保存的鼻拭子樣本56℃滅活處理30 min后加入直徑3 mm鋼珠3粒，將離心管置于Tissuelyser-LT破碎儀中進(jìn)行震蕩5次，50 Hz，30 s/次。震蕩結(jié)束后離心管至4℃離心機(jī)中8000 rmp離心5 min，取離心管中上清液提取病毒RNA，保存于－80℃?zhèn)溆?。CIV RNA提取操作按TIANamp Virus RNA Kit說(shuō)明書于生物安全柜中進(jìn)行。

1.5 CIV基因擴(kuò)增

以提取的病毒RNA為模板，先擴(kuò)增M基因，檢測(cè)是否流感病原學(xué)陽(yáng)性。具體按TakaRa Prime-ScriptTM One Stemp RT-PCR Kit Ver.2說(shuō)明書操作，在0.2 ml PCR管中加反應(yīng)體系共50 μL：2×Onestep RT-PCR buffer 25 μL，酶混合液4 μL，M-229 U/M-229 L（20 pmol/μL）4 μL，無(wú)RNA水14 μL，RNA模板3 μL；其中陰性對(duì)照模板為3 μL無(wú)RNA水。反應(yīng)參數(shù)為：42℃ 30 min；94℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55℃ 45 s，72 ℃ 30 s，30 cycles，72 ℃保溫10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取產(chǎn)物10 μL瓊脂糖凝膠電泳鑒定。有特異性條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序?yàn)镃IV M基因的樣本，按上述方法，用引物cH3N2-602F/cH3N2-1145R擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)為：42 ℃ 30 min；94 ℃ 5min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72℃ 35 s，30 cycles，72℃保溫10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取產(chǎn)物10 μL瓊脂糖凝膠電泳鑒定。有特異性條帶的樣品，分別再用引物cH3N2-HA-l/cH3N2-HA-1701R和cH3N2-NA-l/cH3N2-NA-1403R擴(kuò)增流感HA基因和NA基因，反應(yīng)參數(shù)為：42℃30 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30 cycles，72 ℃保溫10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，產(chǎn)物10 μL經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。擴(kuò)增產(chǎn)物再次送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.6 序列比較分析

測(cè)序序列經(jīng)NCBI中BLASTn比對(duì)確認(rèn)，用Lasergenev7.1 DNAStar軟件進(jìn)行序列整理、校對(duì)和拼接，利用MEGA5.0軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 犬流感血清學(xué)結(jié)果

采集的100份流浪犬血清樣本和150份寵物犬血清樣本進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示，流浪犬CIV抗體陽(yáng)性率58%（58/100），寵物犬CIV抗體陽(yáng)性率5.33%（8/150），見表2。

表2 犬血清流感抗體ELISA方法檢測(cè)結(jié)果

2.2 CIV病原學(xué)結(jié)果

2.2.1 CIV基因擴(kuò)增結(jié)果

M基因擴(kuò)增與測(cè)序鑒定，以CIV鼻拭子樣本RNA為模板，One-step RT-PCR方法擴(kuò)增目的基因，電泳結(jié)果顯示100份流浪犬中有4份樣本的PCR產(chǎn)物可見約229 bp條帶，寵物犬79份樣本中有1份PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期大小相符，見圖1。有特異性條帶的PCR產(chǎn)物純化后送基因公司測(cè)序，經(jīng)BLASTn比對(duì)，所測(cè)序列均為CIV基因。

圖1 鼻拭子樣本M基因擴(kuò)增結(jié)果

H3N2亞型CIV的初步鑒定，將測(cè)序鑒定為CIV的RNA樣本，再次用引物cH3N2-602F/cH3N2-1145R擴(kuò)增，均可見預(yù)期540 bp的特異性條帶，見圖2。

圖2 鼻拭子樣本H3N2亞型初步鑒定結(jié)果

HA和NA基因擴(kuò)增與測(cè)序鑒定，經(jīng)引物cH3N2-602F/cH3N2-1145初步鑒定為H3N2亞型的2份流浪犬RNA樣本和1份寵物犬RNA樣本再次擴(kuò)增HA和NA基因，電泳結(jié)果顯示3份樣本均有1701 bp和1403 bp的預(yù)期大小特異性條帶，見圖3和圖4。

圖3 鼻拭子樣本HA基因擴(kuò)增結(jié)果

圖4 鼻拭子樣本NA基因擴(kuò)增結(jié)果

2.2.2 HA和NA基因測(cè)序分析

測(cè)序序列經(jīng)BLASTn比對(duì)確認(rèn)，用Lasergenev 7.1 DNAStar軟件進(jìn)行序列整理、校對(duì)和拼接，拼接的核苷酸序列再次進(jìn)行BLASTn比對(duì)，可見拼接序列與犬流感H3N2亞型同源性最高，將其分別命名為A/canine/Xinjiang/1/2019(H3N2)、A/canine/Xinjiang/2/2019(H3N2)和 A/canine/Xinjiang/3/2019(H3N2)。

2.2.3 HA基因遺傳進(jìn)化分析

運(yùn)用MEGA5.0軟件構(gòu)建基于HA基因的H3N2 CIV遺傳進(jìn)化樹，見圖5。從遺傳關(guān)系可見，2016年后的H3N2 CIV形成一個(gè)獨(dú)立的分支，本研究測(cè)序的3株CIV也處于此分支。分析病毒分子特征，這一分支的HA蛋白的第226位是Q（谷氨酰胺）、第228位是G（甘氨酸）、146位是S（絲氨酸）、第242位是I（異亮氨酸）。而2006年至2015年期間的CIV HA蛋白的第146位是G（甘氨酸）或S（絲氨酸）、第242位是V（頡氨酸）。

圖5 基于HA基因的H3N2亞型流感毒株遺傳進(jìn)化分析

3 討論

2012年至2017采集自北京、南京、上海和西安的犬樣本CIV H3N2抗體陽(yáng)性率為13.5%（54/399），其中2017年犬H3N2抗體陽(yáng)性率為6.35%，而2012年至2013年期間H3N2亞型抗體陽(yáng)性率為3.5%，抗體陽(yáng)性率的明顯升高表明目前流行的毒株可能更具傳染性[15]。本研究中流浪犬CIV抗體陽(yáng)性率58%（58/100），寵物犬CIV抗體陽(yáng)性率5.33%（8/150）。流浪犬CIV抗體陽(yáng)性率高可能與采樣時(shí)間及采樣群體有關(guān)。流浪犬血清樣本是2019年1月集中采集于流浪犬收養(yǎng)基地，推測(cè)犬群中正在或曾經(jīng)有CIV流行。寵物犬血清采集于寵物醫(yī)院就診犬，時(shí)間相對(duì)分散，樣品相對(duì)較少，無(wú)法考察其流感抗體陽(yáng)性率是否與性別、品種和年齡具相關(guān)性，病原學(xué)陽(yáng)性率低可能與樣本保存時(shí)間相關(guān)。本研究中病原學(xué)檢測(cè)有5份樣品（5/179）可擴(kuò)增出CIV M基因序列，經(jīng)分型引物初步鑒定為H3N2亞型，有2份流浪犬樣本及1份寵物犬樣本可擴(kuò)增出完整的HA和NA基因序列，測(cè)序?yàn)镃IV H3N2亞型。測(cè)序確認(rèn)的4只CIV抗原陽(yáng)性流浪犬其血清抗體也是陽(yáng)性。

HA蛋白負(fù)責(zé)流感病毒與唾液酸受體的結(jié)合、入侵和膜融合，在流感病毒跨種傳播中發(fā)揮重要作用。H3亞型流感病毒，當(dāng)226位為L(zhǎng)（亮氨酸）而228位是S（絲氨酸），HA蛋白結(jié)合人α-2,6受體，而當(dāng)226位是Q（谷氨酰胺）而228位是G（甘氨酸），HA則偏好結(jié)合禽α-2,3受體[16]。LYU Y L等[15]認(rèn)為2016年以后的H3N2 CIV是有別于以前的H3N2亞型并將其取代的新進(jìn)化分支，推測(cè)起源于韓國(guó)或美國(guó)的H3N2 CIV。該分支的HA具有禽α-2,3受體結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)在第146和第242位有氨基酸突變。2006-2015年期間的CIV H3N2亞型HA蛋白第146是G（甘氨酸）和S（絲氨酸）的頻率分別為91.89%和8.11%；第242位是V（頡氨酸）的頻率是100%[15]。而2017年至2019年期間的CIV H3N2亞型HA蛋白第146是S（絲氨酸）和第 242位是 I（異亮氨酸）的頻率均是 100%[15]。人H3N2亞型HA蛋白第146是S（絲氨酸）和G（甘氨酸）的頻率分別是99.57%和0.42%；第242位是I（異亮氨酸）和V（頡氨酸）的頻率分別是99.29%和0.39%[17]。由此可見HA第146S和242I的突變有利于CIV在哺乳動(dòng)物中流行。本研究測(cè)序的3株CIV處于2016年后的新進(jìn)化分支，發(fā)生了適應(yīng)哺乳動(dòng)物的HA第146S和242I突變。

寵物犬和流浪犬已逐漸成為流感病毒進(jìn)化和繁衍的“溫床”，在流感病毒生態(tài)循環(huán)中起到重要作用。目前雖未有強(qiáng)毒型CIV的報(bào)道，但是CIV亞型在持續(xù)增加。借鑒H1N1亞型豬流感pdm09病毒跨宿主感染人之前曾在豬體內(nèi)數(shù)十年循環(huán)適應(yīng)事件，2016年后流行于中國(guó)的進(jìn)化新分支CIV H3N2的哺乳動(dòng)物潛在適應(yīng)性及其公共衛(wèi)生安全需進(jìn)一步評(píng)估。我們應(yīng)積極監(jiān)測(cè)以期及時(shí)阻斷CIV的群體傳播和適應(yīng)，同時(shí)加強(qiáng)檢疫，避免出現(xiàn)更多新亞型CIV。

4 結(jié)論

2019年新疆某地區(qū)犬樣本CIV血清學(xué)檢測(cè)流浪犬和寵物犬抗體陽(yáng)性率分別為58%和5.33%；CIV病原學(xué)檢測(cè)流浪犬和寵物犬抗原陽(yáng)性率分別為4%和1.27%；病原學(xué)測(cè)序分析的3株CIV屬H3N2亞型2016年后新進(jìn)化分支，HA蛋白分析可見第146S和242I突變。HA蛋白中氨基酸哺乳動(dòng)物適應(yīng)突變對(duì)公共衛(wèi)生安全具有潛在威脅。