苦參堿對(duì)番茄根際土壤微生態(tài)的影響

華羚淇 ，寧靜，曾紅*

（1塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

（2塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

果類蔬菜中的番茄（Lycopersicon esculeutumMill），不僅外形美觀，味道鮮美，而且富含多種維生素、礦物質(zhì)和酚類化合物，是良好的保健食品，對(duì)疾病也有一定的預(yù)防功效，具有很高的商品、風(fēng)味與營養(yǎng)價(jià)值，已經(jīng)成為人們生活中必不可少的蔬菜之一，有廣闊的市場前景。近年來，番茄的種植面積在不斷增加，但其優(yōu)質(zhì)化進(jìn)程嚴(yán)重制約著我國農(nóng)產(chǎn)品價(jià)值的進(jìn)一步提升，而通過合理的施肥等方法來改善番茄的品質(zhì)是目前研究的重點(diǎn)之一。

糖的含量是影響番茄果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)的重要指標(biāo)，也是消費(fèi)者評(píng)判番茄好壞的重要標(biāo)準(zhǔn)。番茄果實(shí)中糖分含量的多少與番茄光合物質(zhì)合成、運(yùn)轉(zhuǎn)和代謝密切相關(guān)。植物光合產(chǎn)物運(yùn)轉(zhuǎn)的主要形式是蔗糖，其首先由葉片等“源”器官經(jīng)光合作用產(chǎn)生，經(jīng)過一系列復(fù)雜的運(yùn)輸過程，最終進(jìn)入果實(shí)，在果實(shí)內(nèi)還會(huì)進(jìn)行一系列的生化反應(yīng)，最終形成果實(shí)內(nèi)的總糖。因此葉綠素的含量與果實(shí)的糖分累積密切相關(guān)，合理地施用肥料對(duì)番茄果實(shí)的糖含量有著至關(guān)重要的影響。

苦豆子是中國西北地區(qū)常見的植物，廣泛分布于新疆地區(qū)，當(dāng)?shù)胤N植者在種植作物如甜瓜、西瓜時(shí)，常將苦豆子地上部分作為綠肥施用于作物根際，實(shí)現(xiàn)果實(shí)增甜的效果。苦豆子含有多種生物堿，苦參堿是其主要成分之一。在過往農(nóng)業(yè)相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)苦參堿具有殺蚜活性，經(jīng)苦參堿處理后的豆蚜代謝酶系受到顯著影響，且苦參堿干擾了蟲體對(duì)堿的代謝[1]；在針對(duì)亞洲柑橘木虱的實(shí)驗(yàn)中，苦參堿表現(xiàn)出對(duì)木虱發(fā)現(xiàn)和選擇寄主能力的干擾效果，有效減少了柑橘植株所受侵害[2]。而在番茄植株的研究中，苦參堿的施用提高了番茄第一穗果實(shí)的單果重量，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力[3]。

基于以上考慮，本試驗(yàn)研究在生長期、花期和果實(shí)成熟時(shí)期苦參堿對(duì)番茄葉片葉綠素含量的影響，并從植物根際土壤理化性質(zhì)、酶活性及根際微生物群落結(jié)構(gòu)等角度對(duì)番茄在根際微生態(tài)層面的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析，以期為番茄增甜種植提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

番茄：品種為紫玉，種子購自山東壽光種業(yè)有限公司。苦參堿：純度＞95%，由塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

2020年，在新疆阿拉爾市塔里木大學(xué)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物組織培養(yǎng)室（40°32′46″N，81°17′20″E）進(jìn)行了盆栽試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組（CK）、苦參堿處理組（0.0625 mg/mL、0.1250 mg/mL和0.2500 mg/mL）。2020年9月2日，開始育種，12月25日進(jìn)入花期，花期進(jìn)行人工授粉；2021年1月5日坐果。所有的實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)均沒有使用化肥和除草劑等化學(xué)藥劑。在植株進(jìn)入生長期，于12月2日后，開始分組處理。將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別用清水和苦參堿進(jìn)行灌根處理。灌根法：將清水或不同濃度的苦參堿10 mL分別加入相應(yīng)處理組的番茄植物根部。每隔7 d加一次樣，共加3次。1.2.1 土壤樣品的采集

分別于2020年12月2日（生長期）、2020年12月30日（花期）和2021年1月7日（坐果后）采集根際土壤樣品。用力晃動(dòng)番茄植株根部，以除去根周圍的松散土壤，再用小刷子小心地收集黏附在根部表面的土壤，以獲得根際土壤。使用混樣法，每個(gè)分組隨機(jī)選取三個(gè)平行樣品，并混合樣品。采樣后立刻將根際土壤樣本放入冰盒，并迅速轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，通過60目篩除去植物殘余和土壤動(dòng)物。每個(gè)樣品分為兩部分：一部分在-80℃下保存，用于測定微生物群落多樣性；另一部分室溫風(fēng)干以測定土壤理化性質(zhì)和酶活性。

1.2.2 番茄根際土壤酶活性和理化性質(zhì)的測定

采用碳酸氫鈉法測定土壤有效磷（available phosphorus，AP）含量，將0.5 mol/L NaHCO3溶液以1：20的比例在25°C下以180 r/min振蕩30 min，從土壤樣品中提取土壤有效磷，通過定性脫磷濾紙過濾提取液并使用鉬銻抗比色法分析有效磷含量[4]；使用火焰分光光度法測定土壤樣品中鉀離子（total K+，TK）的含量，將1 mol/L CH3COONH4以1：10的土壤溶液比從樣品中提取土壤鉀離子，樣品在20°C下以180 r/min振蕩30 min，提取液通過定性濾紙過濾，并使用火焰光度計(jì)（philes，中國南京）分析鉀含量。土壤樣品的氮（total nitrogen，TN）含量使用從蘇州科銘生物技術(shù)有限公司（中國）購買的商業(yè)試劑盒測定，測定方法為凱氏法，先用高錳酸鉀將樣品中的亞硝態(tài)氮氧化為硝態(tài)氮后，再用還原鐵粉使全部硝態(tài)氮還原，轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮，將樣品用濃硫酸消煮，使有機(jī)氮分解為銨態(tài)氮。堿化后蒸餾出來的氨用硼酸吸收，以酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，分析土壤全氮含量。

土壤酶活性試劑盒購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司（中國）。以酪蛋白為底物測定堿性蛋白酶（alkaline protease，ALPT）活性。以酚酞磷酸鹽為底物測定堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活性。用靛酚藍(lán)比色法測定脲酶（urease，UE）活性。在好氧條件下，以單酚和雙酚氧化制醌為基礎(chǔ)，測定了多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的活性。用比色法測定蔗糖酶（sucrase，SC）活性。H2O2在 240 nm 下有特征吸收峰，通過測定與土壤反應(yīng)后溶液在此波長下吸光度的變化，即可反應(yīng)過氧化氫酶（catalase，CAT）活性的高低。

1.2.3 根際微生物多樣性

用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取基因組DNA。隨后，使用量子熒光計(jì)和納米滴分光光度計(jì)測定DNA濃度、質(zhì)量和完整性。使用TruSeq DNA樣品制備試劑盒和模板制備試劑盒生成測序文庫。基因組測序由個(gè)人生物技術(shù)公司（中國上海）使用Pacific Biosciences平臺(tái)和Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行。

序列數(shù)據(jù)分析主要使用QIIME和R軟件包（v3.3.0）進(jìn)行。用qime中的OTU表對(duì)OTU水平的a多樣性指數(shù)進(jìn)行計(jì)算，如Chao1豐富度估計(jì)器、ACE度量（豐度覆蓋估計(jì)器）、Shannon多樣性指數(shù)和Simpson指數(shù)。生成OTU水平排序豐度曲線，比較樣品間OTU的豐富度和均勻度。利用UniFrac距離度量[5-6]和主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）進(jìn)行β多樣性分析，以研究樣本間微生物群落的結(jié)構(gòu)變化，非度量多維標(biāo)度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）和算術(shù)平均無權(quán)對(duì)群方法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）分層聚類[7]。使用Student t檢驗(yàn)和1000個(gè)排列的蒙特卡羅排列檢驗(yàn)確定組間成對(duì)比較的Unifrac距離差異，并通過方框圖和胡須圖進(jìn)行可視化。主成分分析（principal components analysis，PCA）也根據(jù)屬級(jí)成分剖面進(jìn)行[7]。使用排列多變量方差分析（permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA）[8]、相似性分析（analysis of similarities，ANOSIM）[9-10]和R軟件包“vegan”評(píng)估各組間微生物群結(jié)構(gòu)分化的顯著性。使用MEGAN[11]和GraPhlAn[12]對(duì)分類組成和豐度進(jìn)行可視化。基于樣品/組間OTU的發(fā)生率（無論其相對(duì)豐度如何），使用R軟件包“VennDiagram”生成了Venn圖，以可視化樣品或組間共享和獨(dú)特的OTU[13]。

在門、綱、目、科、屬和種水平上的分類單元豐度通過Metastats在樣本或組之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較[14]。使用默認(rèn)參數(shù)的線性判別分析效應(yīng)大小（LEfSe）分析檢測組間差異豐富的分類群[15]。利用PLS-DA中R軟件包“混合組學(xué)”的“plsda”功能揭示組間微生物群的變化[16]。隨機(jī)森林分析應(yīng)用于區(qū)分來自不同群體的樣本，使用 R 軟件包“randomForest”分析[17-18]。采用10倍交叉驗(yàn)證法估計(jì)泛化誤差，預(yù)期的“基線”誤差也包括在內(nèi)。通過計(jì)算優(yōu)勢類群之間的Spearman秩相關(guān)進(jìn)行共現(xiàn)分析。使用Cytoscape將|RHO|＞0.6和P＜0.01的相關(guān)性可視化為共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)[19]。微生物功能由軟件PICRUSt根據(jù)高質(zhì)量序列進(jìn)行預(yù)測[20]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

本研究中單個(gè)樣本的所有數(shù)據(jù)均表示為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用SPSS 18.0.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，檢驗(yàn)多組數(shù)據(jù)的平均值。P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為更顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 苦參堿處理后番茄葉片的葉綠素含量及糖含量變化

如圖1結(jié)果所示，在花期時(shí)，番茄葉片CK組的葉綠素含量為0.3560 mg/g，苦參堿濃度為0.0625 mg/mL的處理組的葉綠素含量為0.3682 mg/g，0.1250 mg/mL組的葉綠素含量為0.4935 mg/g，0.2500 mg/mL組的葉綠素含量為0.4329 mg/g。

坐果后，番茄葉片CK組的葉綠素含量為0.5284 mg/g，苦參堿濃度為0.0625 mg/mL的處理組的葉綠素含量為0.8059 mg/g，0.1250 mg/mL組的葉綠素含量為0.5017 mg/g，0.2500 mg/mL組的葉綠素含量為0.9432 mg/g。

圖1 番茄葉片中的葉綠素含量

如圖2結(jié)果所示，在花期時(shí)，番茄葉片CK組的葉片糖含量為3.8510 mg/g，苦參堿濃度為0.0625 mg/mL的處理組的葉片糖含量為3.9792 mg/g，0.1250 mg/mL組的葉片糖含量為1.3990 mg/g，0.2500 mg/mL組的葉片糖含量為2.7772 mg/g。

圖2 番茄葉片中的可溶性糖含量

坐果后，番茄葉片CK組的葉片糖含量為1.1518 mg/g，苦參堿濃度為0.0625 mg/mL的處理組的葉片糖含量為5.4226 mg/g，0.1250 mg/mL組的葉片糖含量為3.6369 mg/g，0.2500 mg/mL組的葉片糖含量為1.5863 mg/g。

2.2 苦參堿處理后番茄植株根際土壤的理化性質(zhì)與酶活性

如圖3結(jié)果所示，在坐果后，施用苦參堿的處理組的根際土壤的氮含量顯著高于空白對(duì)照組。

圖3 番茄根際土壤理化性質(zhì)

相比CK組，苦參堿處理后的番茄根際土壤的多酚氧化酶、脲酶的活性均有顯著提高（如圖4結(jié)果所示）。

圖4 番茄根際土壤酶活性

2.3 施用苦參堿對(duì)番茄根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 微生物群落的α多樣性的影響

通過測序從根際細(xì)菌群落獲得平均130249個(gè)原始序列；使用DADA2方法處理這些序列。剔除低質(zhì)量序列后共獲得109302個(gè)序列，去噪后獲得101313個(gè)有效序列，拼接后獲得61308個(gè)序列，剔除嵌合體后獲得51250個(gè)高質(zhì)量序列，去除singleton后，最后獲得48263個(gè)序列。

對(duì)根際真菌群落進(jìn)行測序，平均獲得139625個(gè)原始序列。剔除低質(zhì)量序列后共獲得118459個(gè)序列，去噪后獲得117714個(gè)有效序列，拼接后獲得116145個(gè)序列，剔除嵌合體序列后獲得112799個(gè)高質(zhì)量序列，剔除單基因序列后獲得112799個(gè)序列。

對(duì)于番茄根際細(xì)菌群落的α多樣性，在苦參堿處理后番茄植株根際細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)、Observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)顯著高于CK組，表明施用苦參堿后根際細(xì)菌群落的豐富度和多樣性有明顯提升（圖5）。

圖5 番茄植物根際細(xì)菌α多樣性分析

對(duì)于番茄根際真菌群落的α多樣性，在苦參堿處理后番茄植株根際真菌群落的Chao1指數(shù)、Observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)高于CK組，表明施用苦參堿后，根際真菌群落的豐富度和多樣性增加（圖6）。

圖6 番茄植物根際真菌α多樣性分析

豐度曲線根據(jù)每個(gè)樣品/組的豐度大小沿橫坐標(biāo)排列操作分類單位（OTU），并將其各自的豐度值作為縱坐標(biāo)。各OTU之間以折線或曲線連接，反映了OTU豐度在各樣品中的分布規(guī)律。對(duì)于微生物群落樣品，該曲線能直觀地反映群落中稀有OTU的高豐度和數(shù)量（圖7）。施用苦參堿的處理組的等級(jí)普遍高于對(duì)照組，這表明苦參堿處理組群落中高豐度和稀有OTU的數(shù)量高于對(duì)照組。

圖7 根際微生物群落的豐度曲線

2.3.2 主坐標(biāo)分析（PCoA）和非度量多維標(biāo)度分析（NMDS）

NMDS用于評(píng)估經(jīng)苦參堿處理的番茄植株根際的微生物群落結(jié)構(gòu)。在番茄開花期，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)如圖8（a）所示；應(yīng)力為0.0349。真菌群落結(jié)構(gòu)如圖8（b）所示；應(yīng)力為0.0554。細(xì)菌和真菌NMDS圖中的應(yīng)力值均小于0.2，說明數(shù)據(jù)是有效的。采用PCoA法對(duì)番茄根際微生物群落功能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。番茄根際細(xì)菌群落功能的PCoA如圖8（c）所示，其中用PCo1和PCo2解釋的百分比分別為71.6%和14.4%。圖8（d）顯示了番茄根際真菌群落功能的PCoA，其中PCo1和PCo2解釋的方差百分比分別為52.0%和21.5%。

圖8 開花期番茄根際微生物群落的NMDS分析和功能單元的PCoA分析

在番茄果實(shí)成熟期，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)如圖9（a）所示；應(yīng)力為0.0334。真菌群落結(jié)構(gòu)如圖9（b）所示；應(yīng)力為0.0783。細(xì)菌和真菌NMDS圖中的應(yīng)力值均小于0.2，說明數(shù)據(jù)是有效的。采用PCoA法對(duì)甜瓜根際微生物群落功能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。番茄根際細(xì)菌群落功能的PCoA如圖9（c）所示，其中用PCo1和PCo2解釋的百分比分別為73.5%和15.5%。圖9（d）顯示了番茄根際真菌群落功能的PCoA，其中PCo1和PCo2解釋的方差百分比分別為83.4%和9.4%。

圖9 成熟期番茄根際微生物群落的NMDS分析和功能單元的PCoA分析

2.3.3 冗余分析

以番茄葉片的葉綠素含量為指標(biāo)，以番茄在各生育時(shí)期根際土壤理化性質(zhì)、土壤酶活性和根際微生物優(yōu)勢菌群為因子，進(jìn)行了冗余分析（redundancy analysis，RDA），以尋找與葉綠素含量存在相關(guān)性的因子。結(jié)果表明，在番茄開花期（圖10）與果實(shí)成熟期（圖11），根際細(xì)菌Aeromicrobium、Aliihoeflea、Blastococcus、Lysobacter、Nocardioides、Pelagibacterium和Salinimicrobium的相對(duì)豐度與葉片的葉綠素含量呈正相關(guān)。對(duì)于真菌，Acaulium的相對(duì)豐度與含糖量呈正相關(guān)。土壤理化性質(zhì)如氮含量和有效鉀含量與葉綠素含量呈正相關(guān)，土壤酶活性如多酚氧化酶、過氧化氫酶、堿性蛋白酶、堿性磷酸酶、脲酶和蔗糖酶的活性均與葉綠素含量呈正相關(guān)。

圖10 開花期根際樣品葉綠素含量、土壤酶活性、理化性質(zhì)和優(yōu)勢微生物屬的RDA分析

3 討論

葉綠素含量是評(píng)價(jià)植株生理的重要指標(biāo)。在番茄花期，施用苦參堿濃度為0.0625 mg/mL、0.1250 mg/mL和0.2500 mg/mL的處理組的植株葉綠素含量分別比對(duì)照組高3.41%、38.60%、21.58%；在成熟期，苦參堿0.0625 mg/mL和0.2500 mg/mL組的葉綠素含量分別比對(duì)照組高52.53%、78.52%這表明施用苦參堿可以有效地提高番茄葉片的葉綠素含量。

在施用苦參堿后，番茄根際土壤酶如多酚氧化酶、脲酶和蔗糖酶的活性均有顯著提升，說明植物吸收營養(yǎng)素及抗逆的能力得到了提升。

施用苦參堿后，番茄根際微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。NMDS圖顯示，苦參堿處理組與對(duì)照組的距離較遠(yuǎn)，說明苦參堿處理組和CK組的微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。此外苦參堿0.0625 mg/mL、0.1250 mg/mL和0.2500 mg/mL的處理組與CK組的距離依次增大，表明群落結(jié)構(gòu)的改變程度與苦參堿的濃度及用量呈正相關(guān)。

功能單元PCoA圖顯示苦參堿處理組與CK組的距離較遠(yuǎn)，說明苦參堿處理組與CK組的微生物群落功能存在顯著差異。此外苦參堿0.0625 mg/mL、0.1250 mg/mL和0.2500 mg/mL處理組與CK組的距離依次增大，表明群落功能的改變程度與苦參堿的濃度及用量呈正相關(guān)。這些結(jié)果表明，苦參堿可以改變番茄根際微生物群落結(jié)構(gòu)和功能。

通過對(duì)比屬分類學(xué)水平下，處理組中相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組的細(xì)菌種群，與RDA分析中與番茄葉片葉綠素含量呈正相關(guān)的細(xì)菌種群，發(fā)現(xiàn)Aeromicrobium、Altererythrobacter、Erythrobacter、Hyphomicrobium、Pedomicrobium、Steroidobacter、Streptomyces和Lysobacter是番茄花期（t2）與番茄葉片葉綠素含量呈正相關(guān)的相對(duì)豐度顯著上升的細(xì)菌；而Ilumatobacter、Nocardioides和Lysobacter是番茄成熟期（t3）與番茄葉片葉綠素含量呈正相關(guān)的相對(duì)豐度顯著上升的細(xì)菌。

同樣的，通過對(duì)比屬分類學(xué)水平下，處理組中相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組的真菌種群，與RDA分析中番茄葉片葉綠素含量呈正相關(guān)的真菌種群，發(fā)現(xiàn)Arthrographis、Byssochlamys、Exophiala、Lophotrichus、Microascus、Paecilomyces、Petriella、Pleurostoma、Scedosporium和Schizophyllum是番茄花期與番茄葉片葉綠素含量呈正相關(guān)的相對(duì)豐度顯著上升的真菌；而Preussia和Talaromyces是番茄成熟期與番茄葉片葉綠素含量呈正相關(guān)的相對(duì)豐度顯著上升的真菌。

4 結(jié)論

在番茄的盆栽實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了苦參堿的效果，施用苦參堿后番茄葉片的葉綠素含量有較顯著提升，并改變了番茄根際的微生物群落結(jié)構(gòu)，如Streptomyces和Lysobacter等有益菌種豐度顯著提升，改善了植株根際的微生態(tài)，促進(jìn)植株的生長，具有良好的應(yīng)用前景。