轉CiNPR4基因柑橘抗潰瘍病的機制解析

張婧蕓，劉語諾，王兆昊，彭愛紅，陳善春，何永睿

西南大學柑桔研究所，重慶 400712

0 引言

【研究意義】柑橘潰瘍病是由柑橘黃單胞菌柑橘致病亞種（Xanthomonas citri subsp. citri，Xcc）引起的細菌性病害，流行于世界主要柑橘產區，每年給柑橘產業造成高達數億美元的經濟損失。柑橘潰瘍病由于危害大、傳播快、難防治，是國內外重要的檢疫性病害[1-3]。培育并推廣抗潰瘍病的優良柑橘新品種是防治柑橘潰瘍病最根本和最有效的途徑，對柑橘產業的健康穩定發展具有十分重要的意義。【前人研究進展】利用抗潰瘍病的柑橘品種與易感品種進行有性雜交，從雜交后代中篩選出抗潰瘍病的后代，是培育抗潰瘍病柑橘品種的途徑之一[4]。但由于柑橘類果樹的遺傳背景高度雜合，基因間緊密連鎖、珠心胚干擾等原因，使得雜交育種的效率較低，難以培養出抗潰瘍病的優良柑橘新品種。近年來，植物基因工程的迅速發展為柑橘品種改良開辟了一條新途徑，使短期內進行柑橘品種的定向改良成為可能[5-6]。植物受到病原物侵染后體內的水楊酸（salicylic acid，SA）水平上升，并由病原物侵入點向周圍進行擴散，誘導植物產生系統獲得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）[7-8]。在SA介導的SAR途徑中，病程相關基因非表達子1（non-expressor of pathogenesis-related genes 1，NPR1）以及兩個NPR1同源物NPR3和NPR4參與了植物對病原物的防御反應[9-11]。植物細胞感知SA信號后，細胞內的氧化還原勢發生變化，NPR1在細胞質中由寡聚體變成單體，并在其C-末端核定位信號的介導下向細胞核中進行移動。在細胞核中，NPR1與TGA 轉錄因子結合，促進病程相關基因（pathogenesis-related gene，PR）的表達，增強植物對病原物的抗性[12-13]。通過導入擬南芥（Arabidopsis thaliana）的NPR1（AtNPR1）已獲得了抗潰瘍病和黃龍病的轉基因柑橘[14-15]。AtNPR1與甜橙基因組中的CtNH1具有較高的同源性，通過超表達CtNH1提高了柑橘對潰瘍病的抗性[16]。進一步的研究表明，超量表達AtNPR1或CtNH1組成型均提高了與防御反應相關的基因如 CsPR1、CsPR2或 Chi1的表達。不同于AtNPR1，AtNPR4調控植株防御反應的方式具有爭議性，LIU等[17]利用反向遺傳學，在研究AtNPR4的功能時發現，AtNPR4突變體 npr4-1對丁香假單胞菌DC3000（Pseudomonas syringe pv. tomato DC3000）敏感；且NPR4正向調控SA和茉莉酸（jasmonic acid，JA）分別誘導的防御反應相關基因PR1和PDF1.2的表達。這些結果表明，AtNPR4正向調控了擬南芥對丁香假單胞菌DC3000的抗性。而另一個AtNPR4突變體npr4-3受丁香假單胞菌ES4326（Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326）和卵菌（Hyaloperonospora parasitica Noco2）誘導后，其抗性或敏感性水平并沒有發生變化；但AtNPR3/4雙突變體npr3-1/npr4-3卻表現出比AtNPR3單突變體npr3-1更高的PR1表達水平和更強的抗丁香假單胞菌 ES4326和卵菌特性，因而推測AtNPR4負向調控了植株的防御反應[18]。DING等[11]在擬南芥原生質體中超量表達 AtNPR4，防御反應相關基因SARD1和WRKY70的表達水平受到了抑制，進一步證明了AtNPR4對植株防御反應的負向調控。耐黃龍病的‘Jackson’葡萄柚受到柑橘黃龍病菌侵染后，其體內的一個CiNPR4（Ciclev10031749m）上調表達[19]。研究表明，在甜橙中導入CiNPR4增加了轉基因植株對柑橘黃龍病的抗性。轉錄組分析證實，黃龍病抗性增強的CiNPR4轉基因植株中與防御反應相關的基因上調表達。這些結果表明超量表達CiNPR4提高了柑橘的內在免疫力[20]。【本研究切入點】異源表達擬南芥AtNPR1能夠同時提高轉基因柑橘對潰瘍病和黃龍病的抗性。但AtNPR4正向還是負向調控植物防御仍具有爭議性，柑橘CiNPR4與柑橘潰瘍病抗性相關性鮮有研究。【擬解決的關鍵問題】以過表達抗黃龍病基因CiNPR4轉基因晚錦橙（Citrus sinensis Osbeck）為材料進行潰瘍病抗性評價，探討 CiNPR4在柑橘潰瘍病菌生物脅迫信號途徑中相關激素應答和抗性誘導的相關性，明確CiNPR4對柑橘潰瘍病的抗性機理。

近日，第三屆中國工業車輛行業新技術（叉車安全）研討會上，林德市場策略及解決方案高級總監陳曉春先生圍繞設備、操作者、場所及管理等四個維度分享了林德如何利用創新為用戶叉車安全作業保駕護航的最佳實踐。會后舉行了第二屆中國工業車輛創新獎（整車獎）頒獎典禮，林德窄通道三向堆垛叉車（搬運機器人）Linde Robotics K-Mat、林德L A B叉車（自動化改裝基礎版）獲得銅獎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試 7個 CiNPR4轉基因株系（N1、N2、N8、N12、N20、N21和N28）[20]以及野生型（WT）晚錦橙均來自于西南大學柑桔研究所國家柑桔品種改良中心。試驗于2020年4月開始，在西南大學柑桔研究所國家柑桔品種改良中心完成。

1.2 CiNPR4轉基因植株的潰瘍病抗性評價

在進行潰瘍病抗性評價前3 d，將Xcc菌株YN1（本實驗室保存）在LB固體培養基上活化[21]。接種前1 d，挑選活化的Xcc置于LB液體培養基中，在220 r/min、28℃的搖床上振蕩培養過夜。用紫外光分光光度計測量菌液的OD600值。用LB液體培養基稀釋菌液，使其OD600值為0.1，繼續在上述培養條件下振蕩培養至OD600值為0.5。菌液置離心管中，在離心機上以5 000 r/min離心10 min，棄上清，收集菌體。加入與上清液等體積的無菌水重懸。將菌液進行連續梯度稀釋1 000倍（5×105cfu/mL）備用。選取完全展開的6個月葉齡CiNPR4轉基因株系和WT植株的葉片，無菌水洗凈，平鋪至150 mm的培養皿中，并在葉柄處放置一塊充分吸水的脫脂棉。用針頭（0.5 mm）在葉脈分左右兩邊針刺葉片，每邊針刺相同孔數，每個針孔接種1 μL上述Xcc稀釋菌液。培養皿用Parafilm膜封口，于28℃、光照16 h·d-1的培養箱中培養。每天觀察一次發病情況，接種后10 d觀察病情并拍照。用ImageJ軟件統計葉片接種點處潰瘍病斑的面積。相對抗病率=轉基因植株的病斑面積/WT植株的病斑面積[22]。試驗3次重復。

這回馬臉發飆了，掄起胳膊，左右開弓，把我當個陀螺抽。起初我還能聽到啪啪的響聲，后來耳朵里只剩下嗡嗡的轟鳴了。馬臉打累了，住了手直喘氣，掏出根醬色的長煙卷，點著后吧嗒吧嗒抽著。

Xcc生長曲線的分析參照PENG等[22]的方法進行。分別于接種后0、1、3、5、7和9 d用直徑為0.5 cm的打孔器取下轉基因植株和 WT植株接種區域的葉圓片，3個葉圓片為一組，放入1.5 mL的離心管中，加入200 μL的無菌水，搗碎，定容至1 000 μL，連續梯度稀釋，取50 μL的菌液涂布LB平板，28℃培養2 d，統計菌斑個數。每平方厘米葉片組織中的 Xcc細胞=（菌斑個數×稀釋倍數×1000）/[50×π（直徑/2）2×3]。試驗3次重復。

1.3 內源SA和JA含量的測定

根據與CiNPR4互作的候選蛋白的cDNA序列以及pGADT7質粒序列，以EcoR I和BamH I為酶切位點，按上述方法設計同源重組引物（表 1）。按照上述 1.4中的方法提取 WT植株的 RNA，并反轉錄成cDNA。以晚錦橙的 cDNA序列為模板，利用同源重組引物對分別進行擴增。參照上述誘餌質粒的構建方法將候選蛋白的cDNA序列插入pGADT7中，獲得獵物質粒pGADT7:候選蛋白。

1.4 RNA的提取和表達分析

按照上述1.3中的方法對CiNPR4轉基因植株和WT植株的葉片進行Xcc接種。分別收集未處理和接種Xcc后0、3和5 d的葉片50 mg，葉片收集后迅速投入液氮中，利用 RNA快速提取試劑盒（RN09，Aidlab，北京，中國）提取總RNA，方法參照說明書。對RNA樣品濃度和質量測定后，將500 ng的RNA用iScriptTMcDNA Synthesis Kit試劑盒反轉錄成cDNA。使用 ABI 7500熒光定量 PCR儀（PE Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）進行CsPR1和CsPDF1.2的表達分析。CsPR1、CsPDF1.2和內參基因Actin的表達分析引物見表1。反應體系（12 μL）：6 μL 熒光染料試劑 iTaqTMUniversal SYBR? Green Supermix（Bio-Rad，Hercules，CA，USA），上、下游引物各0.3 μL，cDNA模板1 μL，加ddH2O至12 μL。采用2-ΔΔCt法[24]，以各自健康的植株為參照，Actin為內參基因，分別計算相應的轉基因植株和WT植株感病后的CsPR1和CsPDF1.2表達水平。試驗3次重復。

1.5 酵母雙雜交分析

CsPR1和CsPDF1.2分別是SA和JA介導的植物防御反應途徑中的標志性基因。為了進一步分析CiNPR4在 Xcc生物脅迫信號途徑相關激素應答和抗性誘導過程中的作用，對Xcc誘導后5個轉基因株系和WT植株葉片中CsPR1和CsPDF1.2的表達情況進行分析。以各自健康的植株為參照，Xcc處理0 d時，所有檢測的轉基因株系和WT植株中CsPR1的表達水平無明顯變化；Xcc處理3 d時，轉基因株系N1、N2、N12、N21和N28中CsPR1的表達水平迅速上升，與WT植株相比存在顯著差異；Xcc誘導5 d時，CsPR1的表達水平在轉基因株系N1、N2和N21中繼續上升，而在N12轉基因株系中有所下降，在N28轉基因株系中基本保持不變，但所有檢測的轉基因株系中CsPR1的表達水平仍然顯著高于WT植株；而WT植株中的CsPR1的表達在Xcc誘導后無顯著性變化（圖2-C），上述結果表明 CiNPR4正向調控轉基因植株體內CsPR1的表達。

以CiNPR4的cDNA序列設計引物對CiNPR4-f/CiNPR4-r（表 1），以 pUC57:CiNPR4質粒（本實驗室保存，此質粒含有CiNPR4的cDNA序列）為模板，擴增獲得CiNPR4的cDNA序列。對酵母載體pGBKT7進行EcoR I單酶切，回收產物與CiNPR4的 cDNA序列通過同源重組試劑盒（Cat639648，TaRaKa，大連，中國）進行同源重組并進行測序驗證，cDNA序列正確的質粒確認為誘餌質粒pGBKT7:CiNPR4。

萌萌噠吧唧吧唧地猛吞幾口，心滿意足地說：“作為一個幸福的當代人，在空調房里吹著暖氣吃雪糕，是對冬天最大的尊重。”

按上述1.2中的方法準備OD600值為0.5的Xcc菌液。采取健康的轉基因植株和WT植株充分展開的葉片，參照DUAN等[23]的方法將OD600為0.5的Xcc菌液用1 mL去針頭的注射器接種轉基因植株和WT植株葉片，于28℃、光照16 h·d-1、相對濕度85%的培養箱中培養。接種后0、3和5 d分別采集0.5 g的葉片。葉片收集后迅速用液氮速凍，用植物激素SA和JA酶聯免疫試劑盒（Sinobestbio，上海，中國）分別測定SA和JA的含量。SA和JA含量測定由賽諾生物科技有限公司（上海，中國）完成。試驗3次重復。

氮磷鉀是植物生長最基本的3種必需大量元素，與其生長密切相關，施用量的不同對植物性狀的表達有不同程度的影響[1-3]。復色紫薇是花色存在特異性的一類紫薇，通過長期栽培實踐發現，這類紫薇對肥料敏感性較高，不同施肥模式會使復色紫薇表現一定的性狀差異[4-8]。關于復色紫薇專項施肥模式即施用方法和施用時間的設計試驗很少有涉及。本研究以3個復色紫薇品種為研究對象，研究在不同施肥方法、肥料配比和施肥時間下復色紫薇性狀的差異，并形成復色紫薇專有的施肥模式。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

誘餌質粒和獵物質粒在酵母菌株Y2HGold中的共轉化以及共轉化子的篩選參照Matchmaker? Gold Yeast Two-Hybrid System（TaKaRa）試劑盒的操作方法進行。此試劑盒中包含載體pGBKT7和pGADT7、酵母菌株Y2HGold、標準的陽性對照（pGBKT7-53和pGADT7-T）和陰性對照（pGBKT7-Lam和pGADT7-T）。

1.6 數據處理

數據使用IBM SPSS 19統計學軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）進行鄧肯方差分析，結果以平均值±標準差顯示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 CiNPR4轉基因植株的潰瘍病抗性分析

分析潰瘍病菌接種后0、1、3、5、7和9 d，5個轉基因株系（N1、N2、N12、N21和N28）晚錦橙葉片內細菌的生長。結果顯示，WT植株接種Xcc后至第7天，接種部位Xcc細菌總量急劇上升，而N1、N2、N12、N21和N28轉基因株系接種部位Xcc細菌總量在整個觀察期的增長較為緩慢。Xcc接種9 d后，對5個轉基因株系和WT植株葉片接種部位的Xcc細菌總量進行方差分析，結果顯示，5個轉基因株系葉片內Xcc細菌總量顯著低于WT植株；N2轉基因株系中 Xcc細菌總量顯著低于 N1株系。這些結果表明CiNPR4的過表達降低了 Xcc在寄主上的生長能力，與表型一致（圖1-D）。

對7個轉基因株系（N1、N2、N8、N12、N20、N21和N28）進行潰瘍病的離體抗性分析。針刺法離體接種Xcc，以WT植株為對照，3 d后轉基因植株和WT植株葉片針刺點有輕微的損傷，針刺孔中有白色且形似愈傷樣的組織。隨著感染時間的延長，白色愈傷樣的組織突出針刺孔，但不同的轉基因株系白色愈傷樣組織團的大小存在差異（圖1-A）。接種Xcc 10 d后，統計植株葉片針刺點的病斑面積，轉基因株系N1、N2、N12、N21和N28的葉片潰瘍病病斑面積顯著低于對照（圖 1-B）。根據病斑面積計算相對抗病率后顯示，轉基因株系N8和N20與WT的相對抗病率無顯著性差異，但 N1、N2、N12、N21和 N28轉基因株系的相對抗病率顯著低于WT植株，分別為WT植株的79.3%、58.5%、65.4%、49.3%和55.6%（圖1-C），表明過表達CiNPR4能夠顯著提高晚錦橙對柑橘潰瘍病的抗性。

誘餌質粒 pGBKT7-CiNPR4分別與獵物質粒pGADT7-CsTGA2和pGADT7-CsTGA6共轉入Y2HGold，并將共轉化子分別涂布在DDO和QDO/X/ABA培養基上。結果表明，所有的共轉化子在 DDO培養基上都生長白色菌斑，而只有CiNPR4與CsTGA2組合在QDO/X/ABA培養基上長出藍色菌斑（圖 3-A）。獵物質粒pGADT7-CsTGA6和pGADT7-CsTGA2分別與pGBKT7空載雜交后在QDO/X/ABA培養基上沒有出現藍色菌斑，表明獵物蛋白本身并不能自激活（圖3-B）。陽性對照pGBKT7-53與pGADT7-Rec存在互作，共轉化后在QDO/X/ABA培養基上長出藍色菌斑，而陰性對照pGBKT7-Lam與pGADT7-Rec不存在互作，共轉化后在QDO/X/ABA培養基上不能生長（圖3-C）。結果表明，CiNPR4與CsTGA2蛋白存在互作。

2.2 CiNPR4轉基因植株中SA和JA含量的變化

接種Xcc 0、3和5 d后，測定植株葉片內SA和JA含量。處理0 d時，轉基因株系N1、N2、N12、N21和N28體內的SA含量與野生型無顯著差異。處理3 d時，N1、N12、N21和N28轉基因植株葉片中SA含量急劇上升，與WT植株相比達到顯著的差異水平，隨著誘導時間的延長，SA水平進一步增加；N2轉基因植株在處理3 d時SA含量達到最高，在處理5 d時SA含量有所下降但仍保持較高水平；而WT植株在整個觀察期間 SA的水平基本保持不變（圖2-A）。

對于轉基因植株體內的JA含量來說，Xcc誘導0 d時，所有檢測的轉基因植株體內含量顯著低于 WT植株的JA含量；Xcc誘導3 d時，JA含量在轉基因植株體內稍微上升，達到與WT植株無顯著差異的水平；Xcc誘導5 d時，JA含量在轉基因植株體內急劇上升，達到比WT植株顯著高的水平；而WT植株在整個觀察期間JA含量無顯著差異（圖2-B）。結果表明，受 Xcc誘導后，CiNPR4的過表達顯著上調晚錦橙葉片內SA和JA含量，對SA和JA在體內的積累有著正向調控作用。

2.3 CsPR1和CsPDF1.2的表達分析

根據CiNPR4蛋白與TGA轉錄因子相互作用網絡，預測 CiNPR4分別與 Ciclev10005080m和Ciclev10001081m 基因編碼的蛋白互作[19]。以甜橙為參考基因組，將這兩個基因在 https://www.citrusgenomedb.org/網站上進行blastx分析[25]，找到與Ciclev10005080m和 Ciclev10001081m基因編碼的氨基酸序列相同或者相似性較高的基因，這些基因所編碼的蛋白為候選蛋白。

通過CiNPR4蛋白與TGA轉錄因子相互作用網絡分析，CiNPR4可能的誘餌蛋白是Ciclev10005080m和Ciclev10001081m，以甜橙基因組為參考，通過氨基酸序列比對，Cs5g11160和Cs1g16230為甜橙中的同源基因，編碼的氨基酸序列具有 100%和 98.9%的相似性。Cs1g16230和Cs5g11160蛋白分別屬于TGA6和TGA2蛋白，因而在本研究中，分別將Cs1g16230和Cs5g11160命名為CsTGA6和CsTGA2。

2.4 酵母雙雜交分析

同樣，以各自健康的植株為參照，Xcc處理 0 d時，所有檢測的轉基因株系和WT植株中CsDF1.2的表達水平無明顯變化；Xcc處理3 d時，CiNPR4過表達株系和WT植株中CsDF1.2下調表達，且轉基因株系與對照之間無顯著差異；Xcc誘導 5 d，CsPDF1.2在所有的CiNPR4轉基因株系和WT植株中的表達水平均上升，但WT植株的CsPDF1.2表達水平顯著高于 CiNPR4轉基因株系（圖 2-D），上述結果表明CiNPR4抑制了轉基因植株體內CsPDF1.2的表達。

術后有5例患者發生并發癥，發生率為1.25%（5/400）。對患者的護理滿意度進行調查，其中218例患者滿意，163例患者一般滿意，19例患者不滿意，護理滿意度為95.25%（381/400）。

為了進一步證實互作的真實性，對 CiNPR4與CsTGA2共轉化子在QDO/X/ABA培養基上長出的藍色菌落進行PCR分析，分別擴增CiNPR4與CsTGA2的基因片段。結果顯示，在CiNPR4與CsTGA2共轉化的酵母菌落中分別能擴增出CiNPR4和CsTGA2基因片段（圖3-D），表明CiNPR4與CsTGA2確實存在互作。

3 討論

在NPR基因家族中，NPR4調控了植物對病原物的防御反應。研究表明，NPR4調控植株的防御反應與其氨基酸序列C-末端的VDLNETP基序有關[11]。分別來源于甜橙和草莓的 NPR4蛋白 CsNPR4和FvNPRL-1氨基酸序列的 C-末端分別含有 IDLNETP和VDLNETP基序[20]，這兩種蛋白負向調控植物對病原物的防御反應[26-27]。將NPR4的VDLNETP基序中‘DLN’3個氨基酸突變成與NPR1相同的‘GVK’后，會導致NPR4的抑制功能喪失[11]。與AtNPR1類似，CiNPR4蛋白氨基酸序列的 C-末端完全缺失VDLNETP基序[20,28]。在柑橘黃龍病易感品種晚錦橙中導入CiNPR4增加了轉基因植株對柑橘黃龍病的抗性，表明不含VDLNETP基序的CiNPR4正向調控了植株的防御反應[20]。在本研究中，過表達CiNPR4抗黃龍病的轉基因晚錦橙，同時也獲得了潰瘍病抗性，進一步證明了CiNPR4能夠正向調控植物防御反應。

不需要放玩具引誘，因為餐椅和餐具本身對于寶寶來講就是個新鮮玩具了，最開始可以允許他探索，適當地“玩”食物或勺子，但是只能在吃飯的時間段“玩”。

柑橘潰瘍病與細菌性白葉枯病的病原菌同屬于黃單胞菌，研究表明，JA信號轉導增加了玉米對細菌性白葉枯病的抗性[29]。相似地，在本研究中，野生型晚錦橙受Xcc感染后，盡管其體內的JA含量并沒有發生顯著變化，但 JA信號轉導途徑中防御反應相關基因CsPDF1.2在感染Xcc 5 d后顯著上調表達，而SA信號轉導途徑中的防御反應基因CsPR1的表達水平在Xcc誘導期間無顯著變化，表明野生型晚錦橙啟動JA信號轉導途徑抵抗Xcc的入侵。這種現象發生的原因可能是野生型晚錦橙受Xcc誘導后調控了JA信號而非JA水平，與OsNPR1調控SA和JA介導的信號而不是它們的水平提高水稻中防御反應相關基因的表達水平結果一致[30]。但是，在晚錦橙中導入CiNPR4后，在Xcc的誘導下，SA和JA的水平都顯著提高，相應地，SA介導的防御反應相關基因CsPR1的表達水平顯著上升，而CiNPR4轉基因植株體內高水平的JA并未強烈地誘導CsPDF1.2的表達，在Xcc誘導5 d時，CiNPR4轉基因植株擁有顯著低于 WT植株的CsPDF1.2表達水平，這些結果表明 CiNPR4促進了SA介導的CsPR1表達，而抑制了JA介導的CsPDF1.2表達，此研究結果不同于AtNPR4正向地調控SA和JA信號轉導途徑中的防御反應相關基因 PR-1和PDF1.2的表達[17]，而與AtNPR1正向地調控SA信號而抑制 JA信號途徑中相關基因的表達結果相同[31]。這種現象的出現可能是因為CiNPR4的C-末端不含有AtNPR4氨基酸序列C-末端的VDLNETP基序，而與AtNPR1的C-末端具有某些相似性。

5.企業與外部利益相關者的和諧是構建和諧企業的重點。企業與外部利益相關者的和諧的基礎是建立企業與外部利益相關者的信任機制。

研究表明，NPR類蛋白不能直接結合 DNA，需要通過與TGA轉錄因子互作，調控SA下游基因的表達[11,32]。本研究表明，柑橘 CiNPR4通過與 CsTGA2轉錄因子互作，對SA和JA分別介導的防御反應相關基因的表達水平進行調控，從而增強轉基因植株對柑橘潰瘍病的抗性。但CiNPR4與CsTGA2形成的復合物是否結合在CsPR1和CsPDF1.2的啟動子上還需進一步的研究。

4 結論

黃龍病抗性增強的CiNPR4轉基因植株獲得了增強的柑橘潰瘍病抗性。CiNPR4與CsTGA2轉錄因子互作，在Xcc的誘導下，通過正向調控SA而抑制JA信號轉導途徑中防御反應相關基因的表達水平，從而提高CiNPR4轉基因植株對柑橘潰瘍病的抗性。