甜菜夜蛾雙重氧化酶基因 SeDuox的克隆、表達及功能分析

付超然，李亞子，吳涵，趙丹?，郭巍,2?，郭曉昌

1河北農業大學植物保護學院，河北保定 071001；2中國農業科學院研究生院，北京 100081

0 引言

【研究意義】甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）屬鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae），是一種世界性分布的多食性重要農業害蟲，農業生產中通常采用化學防治，以及以蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）為代表的生物制劑等進行防治[1]。近年來利用免疫系統對昆蟲進行生物防治的概念逐漸被提出，因此研究甜菜夜蛾的腸道免疫系統對其進行生物防控具有重要意義。Duox-ROS系統是昆蟲調節腸道微生物動態平衡的重要免疫機制，然而，甜菜夜蛾雙重氧化酶（SeDuox）的生物學功能及其對病原微生物的免疫響應尚不清楚。以甜菜夜蛾為研究對象，研究SeDuox在宿主腸道免疫調控中的作用，以及Bt對昆蟲免疫基因的影響，可為甜菜夜蛾的綜合防控提供新的思路和作用靶標。【前人研究進展】昆蟲是世界上種類最豐富、數量龐大且分布廣泛的動物[2]，在生命過程接觸到很多病原體，主要通過昆蟲攝食進入體內，昆蟲通常依靠先天性免疫系統或腸道免疫系統抵御病原微生物的入侵[3-5]，腸道是昆蟲機體免疫反應的第一場所[6]。同時，昆蟲腸道上棲息著大量有利于宿主生長發育繁殖等功能的腸道共生微生物[7-8]。昆蟲具有獨特的腸道免疫防御系統，防御腸道病原微生物的同時又能維持腸道共生菌動態平衡，主要包括物理屏障、Imd信號通路產生的抗菌肽AMP以及Duox介導的活性氧（ROS）系統[9-10]。其中，Duox介導產生的ROS具有殺菌活性，是昆蟲腸道上皮細胞中重要的殺滅病原微生物的效應分子[11-13]。Duox作為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶家族成員之一，其功能比較保守[14]。Duox屬于跨膜蛋白，通常包括鐵還原酶結構域（Ferric）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸結構域（NAD）、N-端鈣離子結合域（EFH）、黃素腺嘌呤二核苷酸結構域（FAD）和過氧化物酶結構域[15]。目前，在果蠅、岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）等昆蟲中證明Duox-ROS系統在維持腸道微生物穩態中發揮重要作用。HA等研究發現雙重氧化酶敲除型Duox-KD果蠅，在腸道感染條件下不能誘導產生ROS，病原微生物不能被有效清除，說明在果蠅腸道上皮細胞中殺滅病原微生物的效應分子 ROS是由Duox介導產生的，從而維持果蠅腸道微生物動態平衡[12-13]。當橘小實蠅（Bactrocera dorsalis）取食病原菌和腸道共生菌后，導致 BdDuox表達量和 ROS水平顯著上調，利用RNAi沉默BdDuox表達，致使腸道細菌群落穩態紊亂，表明BdDuox在橘小實蠅腸道免疫調控中發揮了重要作用[16]。家蠶（Bombyx mori）感染家蠶微孢子蟲后能夠誘導基因持續上調表達，同時細胞內ROS含量增加，說明BmDuox可能參與宿主腸上皮對家蠶微孢子蟲的免疫反應[17]。WEI等研究發現，球孢白僵菌（Beauveria bassiana）通過體壁侵染斯氏按蚊（Anopheles stephens）后，腸道細菌數量顯著增多，造成蚊蟲腸道菌群失衡，并顯著抑制中腸Duox和抗菌肽相關基因的表達[18]。最新研究發現，Bt可以激活小菜蛾（Plutella xylostella）Toll、IMD、JNK 等多條免疫信號通路[19]。細菌分泌的尿嘧啶可以激活 Duox介導產生 ROS，然而與宿主長期協同進化的腸道共生菌喪失分泌尿嘧啶的能力，只有外來病原微生物才可以分泌尿嘧啶，宿主可能是通過此方式將腸道共生菌和病原菌區分開來，以此維持其腸道微生物群落穩態平衡[20]。【本研究切入點】雙重氧化酶（Duox）在一些昆蟲腸道免疫中發揮重要作用，但其在甜菜夜蛾腸道免疫調控中的作用機理，以及Bt與腸道免疫基因的相互作用關系尚未明確。【擬解決的關鍵問題】以甜菜夜蛾為研究對象，通過基因克隆獲得SeDuox全長基因并進行序列分析，利用實時熒光定量 PCR（RT-qPCR）方法進行SeDuox時空表達分析。RNAi技術沉默 SeDuox，研究 SeDuox生物學功能及其對腸道菌群的調控作用，并分析Bt GS36對SeDuox及抗菌肽相關基因的表達調控，以期明確SeDuox在宿主腸道免疫調控中的作用，為甜菜夜蛾綠色防控提供理論指導。

1 材料與方法

試驗于2018年11月至2020年11月在河北農業大學昆蟲分子生物學實驗室完成。

1.1 材料

供試甜菜夜蛾為河北農業大學害蟲生物防治實驗室人工飼養。飼養條件：溫度（26±1）℃，培養箱內的培養相對濕度保持在（65±15）%，光周期為14L﹕10D。

Trans1-T1感受態細胞購于TransGen公司；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態細胞購于TaKaRa公司；大腸桿菌DH10Bac感受態細胞購于Invitrogen公司；Bt GS36由本實驗室保存。pEASY-Blunt克隆載體購于 TransGen公司；pFastBacTMHTA購自Invitrogen公司。

草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）細胞系（Sf9）由本實驗室保存。

1.2 RNA的提取與cDNA的合成

利用 RNA提取試劑盒（TIAGEN公司）提取甜菜夜蛾不同發育時期（卵、1—5齡幼蟲、雄蛹、雌蛹）及4齡幼蟲不同組織（圍食膜、血淋巴、脂肪體、馬氏管、中腸和表皮）的總 RNA，瓊脂糖凝膠電泳（TIAGEN公司）和微量分光光度計（Eppendorf公司）檢測 RNA的質量和濃度。利用反轉錄試劑盒獲得cDNA。

1.3 SeDuox全長基因的克隆

根據甜菜夜蛾中腸轉錄組數據庫獲得 SeDuox全長基因序列，利用DNAMAN V6.0軟件設計基因特異引物SeDuox-F和SeDuox-R，引物序列見表1。以甜菜夜蛾幼蟲中腸cDNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產物純化回收后連接到pEASY-Blunt克隆載體并轉入Trans1-T1感受態細胞，經過 PCR和酶切鑒定獲得的陽性克隆質粒送到華大公司（BGI）測序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 SeDuox序列分析

對SeDuox序列進行生物信息學分析，通過DNAMAN V6.0軟件預測開放閱讀框、編碼氨基酸、蛋白分子量和等電點等；通過NetNGlyc1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）和 NetOGlyc 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc-3.1/）分別進行N-糖基化位點和O-糖基化位點預測；通過SignalP 5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行信號肽預測；通過TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）和 SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）在線軟件對 SeDuox 蛋白跨膜區和結構域進行預測；利用ClustalX和MEGA_X軟件，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹。

1.5 SeDuox-OM片段的克隆與細胞表達

SeDuox為多次跨膜蛋白，針對膜外部分SeDuox-OM（第31—589位氨基酸）進行基因克隆與細胞表達。根據SeDuox-OM序列設計帶有酶切位點的擴增引物，分別在其上游與下游加入BamH I和EcoR I酶切位點，引物名稱為 SeDuox-OM-F和 SeDuox-OM-R，引物序列見表 1。利用上述引物，以純化的SeDuox的PCR產物為模板進行PCR擴增。按照Bacto-Bac? Baculovirus Expression Systems（Invitrogen 公司）說明書，利用Bac to Bac 昆蟲桿狀表達系統在昆蟲細胞Sf9中表達SeDuox-OM蛋白。

1.6 SeDuox時空表達分析

采用 RT-qPCR方法分析甜菜夜蛾不同發育時期和不同組織中SeDuox的轉錄水平。所用內參基因和目的基因的引物名稱分別為SeActin-F和SeActin-R，SeqPCR-F和SeqPCR-R，引物序列見表1。以cDNA為模板，進行RT-qPCR。PCR反應體系（20 μL）：SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，目的基因 cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，加ddH2O補足體系至20 μL。每個樣品進行3次生物學重復。2-ΔΔCt法分析SeDuox的相對表達量，計算公式：

利用SPSS軟件進行差異顯著性分析（t-test，n=3，P＜0.01或0.05）。

1.7 SeDuox的RNAi效應

以甜菜夜蛾幼蟲中腸cDNA為模板，利用T7 Ribo MAXTMExpress RNAi System（Promega）試劑盒合成SeDuox雙鏈RNA（dsSeDuox），綠色熒光蛋白（GFP）為對照，分別以 dsSeDuox-T7-F和 dsSeDuox-R，dsSeDuox-F和 dsSeDuox-T7-R；dsGFP-T7-F和dsGFP-R，dsGFP-F和dsGFP-T7-R為引物PCR擴增獲得合成dsRNA的正、反向模板，引物序列見表1，經 1.2%瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計檢測dsRNA純度和濃度。選取甜菜夜蛾4齡1 d幼蟲為試驗對象，用微量注射器將 2 μL dsSeDuox（8 μg·μL-1）從幼蟲第4—5腹節處緩慢注入至血腔內，注入方向與蟲體血淋巴流動方向一致，以注射dsGFP為對照。注射完成后，幼蟲于正常條件飼養，分別于48 h和72 h時解剖甜菜夜蛾幼蟲中腸組織，提取總RNA，反轉錄合成cDNA，RT-qPCR檢測SeDuox基因沉默情況，反應體系及分析方法同1.6。

1.8 SeDuox RNAi對腸道菌群密度的影響

解剖注射dsSeDuox后48、72 h的甜菜夜蛾幼蟲含內容物的腸道組織，利用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（TIAGEN公司）提取腸道細菌總DNA，RT-qPCR檢測SeDuox干擾后腸道細菌總量、腸道有益菌蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii）及腸道潛在致病菌蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）總量變化，引物名稱分別為16S-F和16S-R，Es-F和Es-R，Bc-F和Bc-R，引物序列見表1，反應體系及分析方法同1.6。

1.9 Bt GS36對SeDuox及抗菌肽基因的表達調控

選取對甜菜夜蛾高活性的 Bt GS36菌株，利用RT-qPCR方法分析甜菜夜蛾幼蟲對Bt的免疫響應。將Bt GS36接種于LB液體培養基，37℃，220 r/min過夜培養。第2天將過夜培養的Bt GS36按1﹕100的比例接種于1/2 LB液體培養基，30℃，220 r/min，38 h時，收集孢晶混合物，保存于-80℃冰箱備用。

將 100 μL Bt GS36 菌液（180 μg·mL-1）均勻涂布于飼料表面，自然風干后，將經過12 h饑餓處理的甜菜夜蛾3齡1 d幼蟲放在飼料上。每個處理設置3個生物學重復，每個重復15頭試蟲，以表面涂布清水的飼料為對照。每隔 12 h解剖收集甜菜夜蛾腸道，RT-qPCR分析SeDuox及抗菌肽基因表達量的變化，抗菌肽基因引物為Attacin-F和Attacin-R，Definsin-F和Definsin-R，PGRP-F和PGRP-R，引物序列見表1，反應體系及分析方法同1.6。

2 結果

2.1 SeDuox序列分析

SeDuox（GenBank登錄號：MN966681）開放閱讀框為4 497 bp，編碼1 498個氨基酸，預測蛋白分子量為171.62 kD，等電點為8.81。NetOGlyc 3.1 Server和 NetNGlyc1.0 Server預測有 12個 O-糖基化位點（60TRKT、63TPAS、66SYAD、84TLSK、165SPNS、212TKRV、571SKLP、1121SDFR、1425SRTS、1427TSMF、1428SMFT、1431TGLK），6個N-糖基化位點（101NRTA、198NGSL、540NSTS、569NASK、743NLTQ、1483NRTR）（圖1）。TMHMM和SMART在線軟件預測SeDuox蛋白包括3個跨膜區，含有過氧化物酶結構域、N-端鈣離子結合域、鐵還原酶結構域、黃素腺嘌呤二核苷酸結構域、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸結構域（圖2）。

2.2 SeDuox系統發育分析

通過NCBI Blast分析比對可知SeDuox氨基酸序列與近緣物種草地貪夜蛾（GenBank登錄號：XP_035439968.1）和斜紋夜蛾（Spodoptera litura）（GenBank登錄號：XP_022813998.1）Duox氨基酸序列相似性最高，分別為91.31%和91.51%。從NCBI數據庫中下載22種昆蟲的Duox氨基酸序列，利用ClustalX軟件與 SeDuox的氨基酸序列進行同源性比對，MEGA_X軟件構建系統發育樹（圖3）發現SeDuox與斜紋夜蛾、草地貪夜蛾的Duox相似度最高，表明 Duox在這幾種昆蟲中同源性較高，親緣關系較近。

2.3 SeDuox及SeDuox-OM的克隆與細胞表達

PCR擴增獲得SeDuox及其膜外編碼基因SeDuox-OM（第31—589位氨基酸），大小分別為4 497和1 677 bp（圖4-A、4-B）。

構建的重組質粒 pFastBacTMHTA-SeDuox-OM，經雙酶切鑒定載體片段和基因片段大小分別為4 856和1 677 bp（圖5-A）。將鑒定正確的重組質粒pFastBacTMHTA-SeDuox-OM轉化至DH10 Bac感受態細胞中，挑取單克隆，經PCR鑒定，獲得條帶大小為4 107 bp，表明重組病毒 Bacmid-SeDuox-OM 構建成功（圖5-B）。鑒定正確的Bacmid-SeDuox-OM經純化后，利用脂質體轉染法轉染昆蟲細胞Sf9。取轉染后72 h的P3病毒上清進行Western blot鑒定。結果表明重組病毒Bacmid-SeDuox-OM成功轉染昆蟲Sf9細胞，并表達 SeDuox-OM 蛋白，分子量約為 80 kD（圖5-C）。

2.4 SeDuox表達模式分析

利用RT-qPCR分析SeDuox在甜菜夜蛾4齡幼蟲不同組織（圍食膜、馬氏管、表皮、血淋巴、脂肪體、中腸）和不同發育時期（卵、1—5齡幼蟲、雌蛹、雄蛹）的表達水平，結果顯示，SeDuox在甜菜夜蛾各組織中均有表達，其中在圍食膜和中腸表達量較高（圖6-A）。不同發育時期中在卵期表達量最高，1齡幼蟲期表達量最低，之后隨著齡期增長呈先升高后降低的趨勢（圖6-B）。

2.5 SeDuox的RNAi效應

根據試劑盒說明書合成dsSeDuox和dsGFP，利用微量分光光度計檢測dsSeDuox和dsGFP的濃度。用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，電泳結果顯示dsSeDuox和dsGFP條帶大小分別為453和420 bp（圖7），可以用于后續試驗。向甜菜夜蛾4齡幼蟲體內注射 dsRNA進行 SeDuox基因沉默，相比于dsGFP對照組，甜菜夜蛾被注射dsRNA后的48 h和72 h，SeDuox表達量分別下調了62.08%和74.94%（圖8），實現了 SeDuox的沉默。

2.6 SeDuox基因沉默對腸道菌群的影響

注射dsSeDuox 48 h和72 h，甜菜夜蛾幼蟲腸道細菌菌群密度顯著高于dsGFP對照組，分別為對照組的55.46倍和7.30倍（圖9-A），其中蒙氏腸球菌密度顯著降低，48 h和72 h時分別下調了78.99%和75.07%，而蠟樣芽孢桿菌密度在72 h時上調了43.75%（圖9-B、9-C），推測SeDuox在維持甜菜夜蛾腸道微生物菌群穩態中起重要作用。

2.7 Bt GS36對SeDuox及抗菌肽基因表達的影響

RT-qPCR分析Bt GS36對SeDuox及抗菌肽相關基因表達量的影響。結果顯示，與對照組相比，取食Bt GS36 48 h時，甜菜夜蛾幼蟲腸道SeDuox的表達量顯著增加，之后表達量逐漸降低，而抗菌肽相關基因表達量相對較低，表明此時宿主主要通過提高SeDuox的表達水平產生腸道免疫響應從而抵抗蘇云金桿菌的侵染（圖10-A）；取食Bt GS36后分析不同時間點抗菌肽基因表達水平，結果顯示，12 h和24 h時，Attacin表達量顯著增加；36 h時，Defensin表達量顯著增加；72 h和96 h，PGRP表達量顯著增加（圖10-B、10-C、10-D）。結果表明，甜菜夜蛾取食Bt GS36后，SeDuox與抗菌肽基因協同作用，調控宿主腸道免疫系統從而抵御蘇云金桿菌的侵染。

3 討論

昆蟲腸道上皮細胞為了防御外來致病菌而同時不影響腸道共生菌的穩定，其必須在免疫應激和免疫耐受之間保持一種穩態平衡，及時地響應腸道微生物群落的變化[21]。已有研究證明，由雙重氧化酶 Duox介導產生的ROS在昆蟲腸道免疫中發揮重要作用[12]。而昆蟲中 Duox蛋白的研究多數關于黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）、橘小實蠅等[16-17]，SeDuox在甜菜夜蛾腸道中的生物學功能尚不清楚。本研究克隆了SeDuox，其開放閱讀框為4 497 bp，編碼1 498個氨基酸。利用NCBI Blast分析比對可知SeDuox與鱗翅目昆蟲斜紋夜蛾、草地貪夜蛾的相似性較高，主要包括過氧化物酶結構域、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸結構域、N-端鈣離子結合域、鐵還原酶結構域和黃素腺嘌呤二核苷酸結構域，與家蠶、橘小實蠅等多種物種相似，系統發育分析結果也表明Duox在不同物種間十分保守，推測其可能具有保守的生物學功能。本研究實現了 SeDuox-OM 蛋白在昆蟲細胞中成功表達，后續可對該蛋白進行功能研究。通過對 SeDuox表達模式分析，SeDuox在圍食膜和中腸中高表達，表明SeDuox可能在甜菜夜蛾腸道免疫中發揮了重要作用；SeDuox從卵期到蛹期均有表達，表明其參與甜菜夜蛾整個生活史。

已有研究證明，在果蠅的腸道上皮細胞中，Duox介導產生ROS作為第一道防線，起著防御主導作用[12]；斑馬魚（Brachydanio rerio var）上皮細胞Duox活化產生H2O2來清除致病菌的侵染[22]；敲除Duox的果蠅，其腸道菌落穩態失衡[20]；橘小實蠅BdDuox的敲除導致宿主腸道細菌總量增加，而腸道共生菌腸球菌的相對豐度降低[16]。本研究利用RNAi技術探究SeDuox的功能，發現SeDuox的沉默可導致甜菜夜蛾腸道菌群載量上調，腸道潛在致病菌蠟樣芽孢桿菌總量上調，腸道共生菌蒙氏腸球菌總量下降，腸道微生物的失調可能引起昆蟲死亡。Bt是重要的殺蟲微生物，廣泛用于害蟲防治，2006年，BRODERICK等研究表明昆蟲腸道微生物是Bt殺蟲活性所必需[23]，消除昆蟲腸道微生物后可降低昆蟲免疫反應，從而顯著降低Bt的敏感性[24]，也有研究者提出不同觀點，認為Bt的殺蟲活性與腸道細菌無關[25]。由于腸道微生物與宿主昆蟲之間有著復雜又密切的關系，Bt殺蟲過程中三者如何相互作用，以及宿主免疫系統如何起調控作用尚未明確。有研究報道甜菜夜蛾幼蟲取食Bt Vip3毒素后，包括AMP在內的大多數免疫應答基因顯著上調，并干擾宿主的腸道微生物群，由此產生的失調反過來又刺激 AMP的表達和Duox產生ROS[26-27]。棉鈴蟲取食Bt SY80后，在特定的時期，其中腸HaDuox表達水平顯著增加[28]。本研究發現甜菜夜蛾攝入Bt GS36后，SeDuox與抗菌肽基因協同作用調控宿主腸道免疫系統從而抵御 Bt的侵染，推測 SeDuox在抵御昆蟲腸道病原物侵入前期發揮重要作用，維持腸道免疫系統穩態和菌群平衡。

4 結論

甜菜夜蛾 SeDuox為跨膜蛋白，具有典型的過氧化物酶結構域，其在昆蟲中具有高度進化保守性。SeDuox在腸道免疫及腸道細菌調控中具有重要作用，可能與抗菌肽基因協同作用進行宿主的免疫調控以抵抗蘇云金桿菌的侵染。