超聲波輔助在羊肉多次凍融中保持理化特性及減少蛋白損失的作用

古明輝，楊澤莎，馬萍，葛鑫禹，劉永峰

陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安 710062

0 引言

【研究意義】羊肉是食藥兩用肉類，蛋白質(zhì)含量高、脂肪及膽固醇含量低，富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，一直深受消費(fèi)者歡迎。近幾年我國(guó)羊肉產(chǎn)值也在穩(wěn)步增長(zhǎng)，市場(chǎng)需求量較大，為保證肉品質(zhì)，大部分羊肉都是以冷凍方式在市場(chǎng)流通[1]。雖然冷凍能抑制大多數(shù)微生物的生長(zhǎng)繁殖、降低酶活性、延長(zhǎng)貨架期、更好地適應(yīng)全球肉類商業(yè)化的進(jìn)程，但在羊肉凍結(jié)時(shí)，水分形成的冰晶體積增大，損傷細(xì)胞膜，解凍后造成汁液流失，損失蛋白等營(yíng)養(yǎng)成分及眾多風(fēng)味物質(zhì)[2]，尤其是羊肉在流通過(guò)程中冷鏈不健全，在其凍藏運(yùn)輸、包裝、零售前的修整及消費(fèi)者購(gòu)買(mǎi)后再次冷藏等，都會(huì)使肉有意或無(wú)意地多次凍融[3]。在多次凍融過(guò)程中，分割肉制品可能會(huì)產(chǎn)生蛋白質(zhì)流失、質(zhì)量損失、色澤和質(zhì)地變化及脂肪氧化等諸多問(wèn)題，肉在品質(zhì)上也要比普通凍結(jié)產(chǎn)品更差[4]。因此，如何有效保證肉經(jīng)多次凍融后的品質(zhì)對(duì)肉類行業(yè)至關(guān)重要，這就要求保障動(dòng)物宰后肌肉在成熟和凍融過(guò)程中盡可能地減緩理化特性變化。【前人研究進(jìn)展】盡管多次凍融過(guò)程中肉品質(zhì)變化不可避免，但適宜的解凍方式可大大降低該損失。目前最常用的解凍方式有空氣解凍和靜水解凍，但由于傳統(tǒng)解凍方式耗時(shí)較長(zhǎng)、物料解凍不均勻、內(nèi)外溫差大，易引起品質(zhì)下降[5]。而超聲波解凍作為一項(xiàng)新技術(shù)，廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，在肉制品中其解凍原理是物品已凍結(jié)區(qū)對(duì)超聲波的吸收比未凍結(jié)區(qū)高出幾十倍，而物品在初始凍結(jié)點(diǎn)附近對(duì)超聲波的吸收能力最大，從而加快肉品解凍。有研究表明[6-7]，超聲波處理有助于肉理化特性的提升，對(duì)于肉成熟后的肉制品腌制、嫩化和延長(zhǎng)肉制品貨架期等也有促進(jìn)作用。張紹志等[8]研究了超聲波頻率、強(qiáng)度和加載方向?qū)山鈨鋈夂穸鹊挠绊懀?duì)超聲波用于冷凍肉的解凍進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)二者間存在較好的一致性。張昕等[9]研究發(fā)現(xiàn)，與靜水解凍相比，超聲波解凍可有效提高雞胸肉解凍速率并顯著改善新鮮度，但解凍后肉品的蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致保水性較差，解凍汁液流失率高且色澤偏暗，其中180 W超聲波解凍對(duì)肉品理化性質(zhì)負(fù)面影響最小。以上研究均證實(shí)了超聲波用于肉組織解凍的可行性。【本研究切入點(diǎn)】目前有關(guān)超聲波解凍是否適用于羊肉以及其解凍的合適功率，特別是羊肉在低溫反復(fù)凍融的凍結(jié)規(guī)律國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道；關(guān)于肌肉及后熟肉品的凍融規(guī)律及不同解凍方法對(duì)單次冷凍肉解凍的研究較多，而缺少超聲波改善肉品質(zhì)方面的研究，尤其是超聲輔助在多次凍融肉理化性質(zhì)及蛋白損失方面的報(bào)道更為少見(jiàn)。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以陜北白絨山羊的背最長(zhǎng)肌作為試驗(yàn)材料，以常用冷藏解凍和靜水解凍為對(duì)照，探索不同功率超聲輔助解凍在減少羊肉多次凍融過(guò)程中品質(zhì)損失方面的有利作用，以期為實(shí)際生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019年10月至2020年6月在陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院進(jìn)行。

1.1 材料與主要試劑

羊肉來(lái)源：本試驗(yàn)所用肉樣品由榆林市洋洸農(nóng)牧業(yè)有限公司提供。選取體重相近（（23.12±1.62）kg）、飼養(yǎng)方式相同的成年陜北白絨山羊，宰后取其左右兩側(cè)的背最長(zhǎng)肌于4℃環(huán)境中成熟24 h，待用。

試劑：無(wú)水乙醇、無(wú)水硫酸銅、硫酸鉀、石英砂、石油醚、氯仿、甲醇、正己烷，均為分析純，科密歐公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BCD-578WPU9CX風(fēng)冷冰箱，長(zhǎng)虹美菱股份有限公司；TA.XT.Plus質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)stable micro system公司；NS800 分光測(cè)色儀，深圳市三恩馳科技有限公司；105防水型食品溫度計(jì)，德國(guó)Testo公司；SDC-6低溫恒溫槽，寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；SB-4200DTD超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；ME21數(shù)碼生物顯微鏡，奧林巴斯公司；2010 ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀，日本HITACHI公司。

1.3 樣品處理

選取3只羊胴體的背最長(zhǎng)肌（每塊背最長(zhǎng)肌約2 kg），剔除脂肪組織、筋膜，進(jìn)行等厚（1.5 cm左右）切分。把每塊（共3塊）羊胴體的背最長(zhǎng)肌作為單個(gè)樣本分為5組，其中3組進(jìn)行不同功率的超聲解凍，其他2組分別為冷藏解凍對(duì)照、靜水解凍對(duì)照，均經(jīng)聚乙烯自封袋密封包裝，每組4份（袋），共20份（每份肉（80±0.5）g，80×20=1 600 g）。

超聲處理方法：羊肉樣品放置-18℃冷凍24 h，將數(shù)字溫度計(jì)插入其中心位置（肉樣中心溫度達(dá)-16℃），然后樣品放在超聲波清洗機(jī)（外接低溫恒溫槽外循環(huán)系統(tǒng)控制恒定溫度）中 4℃下進(jìn)行解凍，直至樣品中心溫度達(dá)到（2.0±0.5）℃解凍停止[9]，為一個(gè)凍融循環(huán)；解凍的超聲波頻率均為40 kHz，功率分別設(shè)定為180、320 和 400 W[10]，命名為 UT180、UT320 和 UT400試驗(yàn)組；樣品置于超聲波清洗機(jī)水槽中距離槽底（10±0.5）cm處水平固定以保證樣品周?chē)暡◤?qiáng)度的均勻性[11]；超聲波處理采用超聲 1 min后暫停 0.5 min方式，以減少肉樣局部過(guò)熱[12]，UT180、UT320和UT400試驗(yàn)組解凍持續(xù)時(shí)間分別為（27.50±1.48）、（21.25±1.24）和（16.32±1.20）min。

未經(jīng)超聲處理的 2組肉樣，循環(huán)凍融條件為-18℃冷凍24 h，分別以4℃冷藏解凍12 h[13]、4℃靜水解凍60 min[14]作為對(duì)照組，命名為L(zhǎng)T和WT對(duì)照組。

各組樣品分別按照上述處理方法進(jìn)行凍融，從處理當(dāng)天（第0天初始樣，CON組）開(kāi)始，經(jīng)1、3、5、7次凍融循環(huán)結(jié)束后取樣一次，整袋取樣，得到不同次數(shù)解凍后的待測(cè)樣品，以“凍融次數(shù)-組名稱”命名。每次取樣后進(jìn)行相關(guān)理化指標(biāo)的測(cè)定，同時(shí)選取3、7次解凍后的待測(cè)樣品進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)及氨基酸的測(cè)定。

1.4 理化特性指標(biāo)測(cè)定

汁液流失：解凍前將肉樣從自封袋取出稱質(zhì)量為W1，解凍后用吸水紙吸干稱其質(zhì)量為 W2，汁液流失率（%）＝（1-W2/W1）×100。

pH：按照GB 5009.237—2016《食品pH值的測(cè)定》進(jìn)行檢測(cè)。

色澤：采用色差儀進(jìn)行黑白板校正測(cè)色儀后，測(cè)定樣品色度 L*（亮度）、a*（紅度）、b*（黃度）值，并計(jì)算色相角[h°=arctan(b*/a*)]和總色差[ΔE=(ΔL*2+Δa*2+Δb*2)0.5，其中 ΔL*、Δa*和 Δb*分別是L*、a*和b*的樣品在第0天與凍融1、3、5、7次之間的差值]。測(cè)試前將解凍完全的肉樣在低溫避光環(huán)境中暴露約15 min，放置在光源上方，平行測(cè)量3次，取平均值。

硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值：按照 GB 5009.181—2016《食品中丙二醛的測(cè)定》，第二法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果用每千克肉中丙二醛的毫克數(shù)表示。

物性指標(biāo)：將完全解凍后的試驗(yàn)樣品剪成1.5 cm×1.5 cm×0.5 cm的肉塊，采用質(zhì)構(gòu)儀參數(shù)設(shè)置：P36R探頭；測(cè)前、測(cè)中、測(cè)后速度均為1.0 mm·s-1；測(cè)試時(shí)間間隔5 s；觸發(fā)力5 g；數(shù)據(jù)采集速率400 PPs；應(yīng)變量均為75%，測(cè)定硬度、彈性、內(nèi)聚性和回復(fù)性4個(gè)TPA指標(biāo)[2]。

脂肪酸：按照GB/T 5009.168—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪酸的測(cè)定》進(jìn)行檢測(cè)，GC-MS檢測(cè)條件參照張婷[15]的方法。采用MS譜庫(kù)相似度檢索定性及峰面積定量分析，并利用峰面積歸一化法測(cè)定各脂肪酸的相對(duì)含量。

1.5 顯微結(jié)構(gòu)及氨基酸測(cè)定

顯微結(jié)構(gòu)：參考 GUO等[16]的方法，每個(gè)處理選擇 3個(gè)樣品，將肉樣用4%多聚甲醛進(jìn)行過(guò)夜固定，經(jīng)包埋、切片、HE染色等處理后，采用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

氨基酸：按照GB/T 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》，取肉樣0.3 g，用6 mol·L-1鹽酸于110℃水解24 h，脫酸后，用蒸餾水定容至5 mL，用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行檢測(cè)。鑒定出的氨基酸含量（平均值）結(jié)果用熱圖表示，單位為 g·kg-1。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

所有數(shù)據(jù)使用Excel 2013軟件整理，利用R語(yǔ)言3.5.1軟件的pheatmap包進(jìn)行熱圖繪制和聚類分析（類平均法）。采用SPSS 21.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析和主成分分析，多重比較方法采用 Duncan法，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 多次凍融羊肉的汁液流失變化

多次凍融羊肉的汁液流失變化如圖 1所示。總體上，隨著凍融次數(shù)的增加，5組羊肉汁液流失均呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，利用線性擬合趨勢(shì)線，得出LT、WT較初始樣品汁液流失增加速率為 1.31%和0.90%，而UT400、UT320及UT180超聲處理均較初始樣品增加速率分別為1.57%、1.15%和0.93%，可見(jiàn)超聲一定程度增加汁液流失，尤其是UT400和UT320組羊肉在凍融3次后其汁液流失顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而UT180組的汁液流失在凍融3次后增加速率最低，且在凍融7次時(shí)UT180組的汁液流失顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明 UT180的解凍效果最好，優(yōu)于高功率超聲解凍和常見(jiàn)解凍方法。可見(jiàn)，多次凍融后常見(jiàn)解凍方法和超聲解凍均會(huì)造成羊肉汁液流失，功率越大凍融損失越大，但180 W低功率的超聲處理有利于減少羊肉凍融過(guò)程中的汁液流失。

2.2 多次凍融羊肉的pH變化

多次凍融羊肉的pH變化如圖2所示。隨著凍融次數(shù)增加，5組羊肉pH整體呈現(xiàn)降低的變化趨勢(shì)且在第7次出現(xiàn)輕微反彈，pH變化總體范圍較小，為5.31—5.81。5次凍融內(nèi)LT、WT較初始樣品pH降低速率為 0.071和 0.051，而 UT400、UT320及 UT180超聲處理均較初始樣品降低速率分別為0.066、0.061和 0.082，可見(jiàn)超聲比對(duì)照會(huì)在一定程度降低pH，尤其是UT180組的pH在凍融5次時(shí)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。因此，多次凍融后常見(jiàn)解凍和超聲解凍均會(huì)使pH有所降低，UT180解凍pH變化相對(duì)大一些。

2.3 多次凍融羊肉的色澤變化

多次凍融羊肉的色澤變化如表1所示。隨著羊肉凍融次數(shù)的增加，5組羊肉的L*和a*值均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，而b*值隨凍融次數(shù)逐漸增加。在多次凍融過(guò)程中，超聲組的L*值低于對(duì)照組，尤其是UT320組的L*值最低（P<0.05），而UT180組的L*值在凍融3、7次時(shí)與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。在多次凍融過(guò)程中，UT180組羊肉a*值最低，UT320組在3—7次凍融時(shí)a*值最高；隨凍融次數(shù)增加，LT、WT較初始樣品a*值的降低速率為0.249和0.245，而UT400、UT320及UT180超聲處理較初始樣品降低速率分別為0.268、0.212和0.275，可見(jiàn)超聲在一定程度降低a*值，尤其是UT180組羊肉的a*值降低速率最高，凍融期間a*值均低于對(duì)照組，而UT320超聲能減緩 a*值降低，且在凍融期間與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。隨凍融次數(shù)增加，LT、WT較初始樣品 b*值增加速率為0.295和0.319，而UT400、UT320及UT180超聲處理均較初始樣品增加速率分別為0.229、0.227和0.274，可見(jiàn)超聲降低 b*值，尤其是UT320組羊肉的速率最低，在凍融期間b*值均顯著低于對(duì)照組（P <0.05）；在凍融期間，UT320組羊肉的b*值均最低（P <0.05），而其余兩組超聲處理組與對(duì)照組的 b*值整體上無(wú)顯著區(qū)別（P＞0.05），且在凍融7次時(shí)，UT400、UT320及UT180的b*值分別是LT組的93%、84%和96%，同時(shí)分別是WT組的95%、86%和98%。

表1 多次凍融羊肉色澤的測(cè)定結(jié)果Table 1 Color determination results (L*, a*, b*, h°, ΔE) for multiple freeze-thaw mutton

此外，5組羊肉的h°和ΔE值均隨凍融次數(shù)逐漸增加，說(shuō)明在凍融過(guò)程中羊肉會(huì)出現(xiàn)一定程度的褪色。在多次凍融過(guò)程中，LT組和UT180組的h°值最高（P＜0.05），UT320組的 h°值最低（P＜0.05），說(shuō)明320 W功率的超聲輔助解凍處理有利于羊肉色澤穩(wěn)定；而UT320組的ΔE值最高（P＜0.05），其次是UT180組和UT400組，說(shuō)明超聲輔助解凍能顯著影響凍融羊肉色澤，而由于UT320組的L*值最低，則320 W功率的超聲處理羊肉色澤變化最大。總之，多次凍融后，常見(jiàn)解凍方法和超聲解凍均會(huì)降低羊肉亮度和紅度，增加其黃度，但320 W功率的超聲輔助解凍處理有利于羊肉色澤穩(wěn)定，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致肉色變暗，而180 W超聲處理會(huì)使羊肉的紅度降低。

2.4 多次凍融羊肉的物性變化

多次凍融羊肉的物性變化如圖3所示。隨著羊肉凍融次數(shù)的增加，5組羊肉的硬度均呈現(xiàn)明顯降低趨勢(shì)，且超聲組的羊肉硬度低于對(duì)照組，可見(jiàn)超聲比對(duì)照降低羊肉硬度，且功率越大，硬度越小；尤其是UT400羊肉在凍融期間最低（P＜0.05），而UT320和UT180組之間在凍融1、5、7次時(shí)硬度均無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明兩組超聲處理的效果相當(dāng)；在凍融7次時(shí)，UT400、UT320以及UT180組的硬度較初始樣品分別降低了47.01%、37.02%和 37.74%；且在凍融7次時(shí)，UT400、UT320及UT180的硬度值分別是LT組的70%、83%和82%，同時(shí)分別是WT組的110%、131%和129%。5組羊肉的彈性整體呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，第1次凍融后，LT對(duì)照組的彈性最高（P＜0.05），而超聲組與WT對(duì)照組凍融3次后的羊肉彈性值無(wú)顯著差異（P＞0.05），且 UT400組的彈性值最低；凍融7次時(shí)，UT400、UT320以及UT180組的彈性較初始樣品分別降低了22.17%、16.17%和18.94%；且在凍融7次時(shí)，UT400、UT320及UT180的彈性值分別是LT組的85%、91%和88%（P＜0.05），同時(shí)分別是WT組的97%、104%和101%（P＞0.05）。隨著羊肉冷藏凍融次數(shù)的增加，5組羊肉的內(nèi)聚性整體呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，且 LT對(duì)照組在凍融 3次時(shí)達(dá)到最高值（0.59），顯著高于超聲處理組（P＜0.05）。隨著羊肉凍融次數(shù)的增加，5組羊肉的回復(fù)性有降低趨勢(shì)但整體趨于穩(wěn)定，尤其是UT320和UT180組超聲處理效果最好，且這兩組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），同時(shí)LT對(duì)照組在凍融3次時(shí)達(dá)到最高值（0.42），顯著高于超聲處理組（P＜0.05）。總之，多次凍融后，常見(jiàn)解凍方法和超聲解凍均會(huì)降低羊肉硬度、彈性以及回復(fù)性，增加其內(nèi)聚性。與常見(jiàn)解凍方法相比，超聲輔助解凍處理會(huì)降低羊肉硬度，且功率越高越嚴(yán)重；超聲輔助解凍不影響多次凍融羊肉的內(nèi)聚性，同時(shí)320 W和180 W超聲功率輔助解凍有利于羊肉回復(fù)性的穩(wěn)定。

2.5 多次凍融羊肉的脂肪氧化變化

多次凍融通常會(huì)加速脂肪氧化，特別是成年陜北白絨山羊背最長(zhǎng)肌脂肪含量（6.62%左右）相對(duì)較高[17]，氧化更為嚴(yán)重。同時(shí)，肉中脂肪氧化產(chǎn)生的自由基和過(guò)氧化物會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)的氧化[18-19]，進(jìn)而對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)造成負(fù)面影響來(lái)降低肉品質(zhì)[20]。本研究主要對(duì)羊肉多次凍融過(guò)程中脂肪氧化情況（2-硫代巴比妥酸法）進(jìn)行分析，結(jié)果如圖 4-a所示。5組羊肉的TBARS值隨著凍融次數(shù)增加均先減小（0—3次凍融）后增加（3—7次凍融）；在多次凍融過(guò)程中，UT400組的羊肉 TBARS值最高，且顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而UT320和UT180組與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；在凍融 7次時(shí)，UT400、UT320及 UT180的TBARS值分別是LT對(duì)照組的106%、92%和88%，同時(shí)分別是WT對(duì)照組的110%、96%和92%，說(shuō)明UT320和UT180超聲處理有利于減緩羊肉脂肪氧化。為進(jìn)一步說(shuō)明不同解凍處理羊肉脂肪氧化情況，針對(duì)性地選取7次凍融結(jié)束的羊肉對(duì)其脂肪氧化產(chǎn)物（脂肪酸）進(jìn)行分析（圖4-b）。肉品脂肪氧化會(huì)造成不飽和脂肪酸的氧化降低，從而導(dǎo)致SFA含量的增加，5組羊肉的 PUFA含量均顯著低于 CON組（P＜0.05），且其SFA均高于CON組，說(shuō)明多次凍融會(huì)造成脂肪氧化；與對(duì)照組相比，UT400組的羊肉PUFA最低，而SFA最高（P＜0.05），說(shuō)明羊肉脂肪氧化加劇；UT320和UT180組的PUFA含量顯著高于LT對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明這兩組具有一定的改善作用，同時(shí)UT320組的PUFA、MUFA以及SFA含量均與WT對(duì)照組的含量無(wú)顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明兩組具有相似的效果。總之，羊肉脂肪酸與TBARS結(jié)果相一致，說(shuō)明多次凍融后，常見(jiàn)解凍方法和超聲解凍均會(huì)造成羊肉脂肪氧化，尤其是400 W超聲輔助解凍處理會(huì)加劇脂肪氧化，而320 W和180 W 超聲輔助解凍有利于減緩這一過(guò)程，且效果與靜水解凍相當(dāng)。

2.6 多次凍融羊肉的品質(zhì)分析

由凍融羊肉各理化特性間的相關(guān)系數(shù)矩陣圖（圖5-a）可知，各指標(biāo)間存在一定的相關(guān)性。其中，汁液流失、TBARS、b*之間存在一定的正相關(guān)，pH、L*、a*之間存在正相關(guān)；而汁液流失與pH、L*、a*存在一定負(fù)相關(guān)，a*與 b*、TBARS存在負(fù)相關(guān)，表明凍融羊肉pH、汁液流失及TBARS變化可以影響肉品色澤。進(jìn)一步利用主成分分析法將羊肉 10個(gè)品質(zhì)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為2個(gè)主成分，評(píng)價(jià)不同解凍處理對(duì)凍融羊肉理化特性的影響。如圖5-b所示，第1主成分的貢獻(xiàn)率為66%，前2個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率為89%，說(shuō)明它們基本涵蓋了原始變量的所有信息。圖中間隔距離可說(shuō)明不同樣品間的品質(zhì)差異，間隔越遠(yuǎn)說(shuō)明其品質(zhì)特性差別越大。隨著凍融次數(shù)的增加，各處理組羊肉的主成分分布逐漸向右方移動(dòng)，逐漸遠(yuǎn)離CON組，即品質(zhì)越來(lái)越差。在羊肉多次凍融過(guò)程中，LT組與超聲處理組差異較大，表明冷藏解凍呈現(xiàn)與超聲輔助解凍不一致的品質(zhì)變化，結(jié)合理化特性指標(biāo)，說(shuō)明超聲輔助解凍優(yōu)于冷藏解凍。同時(shí)，在PC2方向上可以很好地區(qū)分開(kāi)不同解凍處理間的凍融羊肉，且隨著凍融次數(shù)的增加，各組羊肉的主成分分布總體上向下方移動(dòng)，說(shuō)明其品質(zhì)越來(lái)越差。相同凍融次數(shù)的UT320組主成分均分布在最上方，說(shuō)明320 W超聲輔助解凍效果最好，更有利于解凍羊肉品質(zhì)的保持；而 LT組主成分均分布在最下方，則更進(jìn)一步說(shuō)明傳統(tǒng)冷藏解凍效果差，降低羊肉凍藏品質(zhì)。

2.7 多次凍融羊肉的顯微結(jié)構(gòu)變化

本研究采用顯微切片評(píng)估羊肉多次凍融肌肉微觀結(jié)構(gòu)的變化（圖 6），常見(jiàn)解凍方法和超聲解凍羊肉的顯微結(jié)構(gòu)均隨著凍融次數(shù)的增加，結(jié)構(gòu)變得不緊致、排列變得疏松、形狀變得離散。在相同凍融次數(shù)下，UT320、UT180、WT、LT與UT400組的肌纖維排列逐漸疏松、結(jié)構(gòu)松弛。尤其凍融7次時(shí)的UT400組和LT對(duì)照組肌纖維結(jié)構(gòu)完整性完全喪失，致密結(jié)構(gòu)幾乎被全部破壞；WT對(duì)照組肌纖維結(jié)構(gòu)完整性喪失嚴(yán)重，致密結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞；然而，UT320和UT180組的肌纖維結(jié)構(gòu)相對(duì)完整。因此，多次凍融后常見(jiàn)解凍方法和超聲解凍均會(huì)造成羊肉肌纖維結(jié)構(gòu)破壞，而320和180 W功率的超聲輔助解凍處理有利于維持羊肉肌纖維結(jié)構(gòu)的完整性，且效果以320 W更佳。

2.8 多次凍融羊肉氨基酸的變化

為進(jìn)一步說(shuō)明不同凍融處理的羊肉纖維結(jié)構(gòu)破壞造成的肉蛋白損失情況[4,21]，針對(duì)性地選取3、7次凍融的羊肉對(duì)其蛋白中氨基酸種類及含量進(jìn)行分析（圖7-a）。在羊肉多次凍融過(guò)程中，由于汁液流失的濃縮效應(yīng)，會(huì)造成羊肉氨基酸含量的增加，7-LT組的氨基酸含量最高，說(shuō)明冷藏解凍使其營(yíng)養(yǎng)流失嚴(yán)重。氨基酸種類聚類分析表明，羊肉中 Glu、Pro含量較高，Met、Thr、Tyr、His、Val、Ser、Gly、Ile 和 Phe 含量較低，其中Thr、Val和Ile隨凍融次數(shù)增加而含量相對(duì)穩(wěn)定。5組羊肉樣品在常見(jiàn)解凍方法和超聲解凍處理?xiàng)l件下，用16個(gè)氨基酸指標(biāo)含量作為聚類變量，樣品可分為6類：CON和凍融3次的超聲輔助解凍處理組為第1類，氨基酸營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)最高，說(shuō)明超聲解凍有利于羊肉氨基酸品質(zhì)的保持，且其中 CON組與3-UT320組更接近，說(shuō)明320 W超聲功率解凍羊肉的效果更好；7-UT400、7-WT、3-WT和 7-UT180組為第2類，品質(zhì)相對(duì)較差，說(shuō)明靜水解凍有利于羊肉凍融過(guò)程中氨基酸含量穩(wěn)定；7-UT320、3-LT和7-LT各為1類，品質(zhì)一般，說(shuō)明冷藏解凍在羊肉凍融過(guò)程中氨基酸含量差異較大，不利于其品質(zhì)保持。該聚類結(jié)果與之前的理化特性分析得到相似的結(jié)果，較好地反映出多次凍融羊肉在常見(jiàn)解凍方法和超聲解凍處理間的差異性。

多次凍融羊肉必需氨基酸比例變化如圖 7-b所示，初始EAA/TAA和EAA/NEAA值分別為37%和59%。根據(jù)FAO/WHO規(guī)定的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，氨基酸組成 EAA/TAA比例在 40%左右，EAA/NEAA在60%以上，因此，羊肉凍融前的必需氨基酸組成和比例不佳；在羊肉凍融3次時(shí)，UT320組相比CON組其組成比例變得更差，而其余各組的EAA/TAA值逐漸接近40%，EAA/NEAA值均在60%以上，說(shuō)明其必需氨基酸組成合理、比例平衡，但超聲處理組的羊肉EAA/NEAA值明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明超聲輔助解凍會(huì)造成蛋白損失，從而破壞必需氨基酸組成和比例平衡；相比羊肉凍融3次，凍融7次UT320和UT180組的羊肉必需氨基酸組成和比例基本保持穩(wěn)定。與對(duì)照組相比，UT180組的羊肉有更好的必需氨基酸品質(zhì)，說(shuō)明180 W超聲輔助解凍處理有利于羊肉必需氨基酸組成合理、比例平衡。

因此，多次凍融后常見(jiàn)解凍方法和超聲解凍均會(huì)造成羊肉蛋白損失，但超聲輔助解凍有利于羊肉氨基酸品質(zhì)的保持，尤其是320 W超聲凍融的羊肉效果最好，但超聲也會(huì)破壞必需氨基酸組成和比例平衡，而180 W超聲輔助解凍的能減緩這一過(guò)程，保持羊肉必需氨基酸組成合理、比例平衡。

3 討論

3.1 超聲波輔助保持多次凍融羊肉的理化特性

目前采用的多種凍肉解凍方法均存在一些缺陷，如解凍汁液流失率高、脂肪氧化嚴(yán)重、物料解凍不均勻、內(nèi)外溫差大等，易引起品質(zhì)下降[5]。而在肉類流通過(guò)程中不可避免地出現(xiàn)不同解凍方式的交叉凍融問(wèn)題，本研究單一地比較冷藏、靜水以及超聲波 3種方式對(duì)羊肉進(jìn)行反復(fù)解凍，主要是保證試驗(yàn)的一致性，進(jìn)一步系統(tǒng)證實(shí)了超聲波用于肉組織解凍的可行性。研究發(fā)現(xiàn)較傳統(tǒng)靜水和冷藏解凍，羊肉在320 W和180 W功率下的超聲輔助解凍處理具有更優(yōu)異的品質(zhì)保持能力。通過(guò)試驗(yàn)及主成分綜合分析，320 W超聲輔助解凍對(duì)羊肉品質(zhì)影響最小，解凍效果最佳。

肉物性直接關(guān)系著肉的嫩度、口感[22]。與常見(jiàn)解凍方法相比，超聲輔助解凍處理會(huì)降低羊肉硬度，且功率越高越明顯。硬度降低可以改善羊肉的嫩度[23]，究其原因主要是由于超聲波本身的機(jī)械作用會(huì)破壞溶酶體并誘導(dǎo)溶酶體酶的釋放，而溶酶體酶可部分參與肌原纖維蛋白的降解，進(jìn)而導(dǎo)致肌原纖維結(jié)構(gòu)強(qiáng)度的減弱[24]。另一方面，超聲也可以在一定程度上使肌原纖維斷裂以降低羊肉硬度，而提高肉的嫩度，這與本研究羊肉硬度減小的結(jié)果一致[25]。此外，本研究中320 W和180 W超聲功率均有利于羊肉回復(fù)性的穩(wěn)定，推測(cè)主要由于凍融過(guò)程中脂質(zhì)氧化可以誘導(dǎo)肌肉形成蛋白質(zhì)-脂質(zhì)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，然而超聲可以通過(guò)降低由氧化造成的肌原纖維降解來(lái)穩(wěn)定蛋白質(zhì)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，以穩(wěn)定羊肉的物性變化[26]。

180 W功率的超聲輔助解凍處理有利于減少羊肉凍融過(guò)程中的汁液流失，可能是由于超聲波促進(jìn)溶液水分快速滲透，“空化效應(yīng)”導(dǎo)致的空洞可容納更多的水分和小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，保水性增加[23]。此外，解凍時(shí)間、水的重吸收、肌肉組織完整性、肌肉蛋白狀態(tài)以及保水能力都是造成超聲波解凍肉失水的重要因素[27]。羊肉蛋白中肌球蛋白占比最大，并含有豐富的螺旋結(jié)構(gòu)[28]。超聲處理已證明可改善肌球蛋白的結(jié)構(gòu)特征，增加巰基的含量以及將α-螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)檩^松散的β-折疊結(jié)構(gòu)，這可能減少致密聚集并提高肌肉蛋白的保水力[29]。但是，肌原纖維的結(jié)構(gòu)在400 W時(shí)可能會(huì)嚴(yán)重受損，從而在解凍時(shí)肌纖維細(xì)胞大量失水，汁液流失增加[30-31]。相比常見(jiàn)解凍方法，320 W功率的超聲輔助解凍處理有利于羊肉的色澤（紅度和黃度）穩(wěn)定，這可能是由于超聲波功率越高，解凍速率相對(duì)越快，使色素的降解量越少所致[32]。多次凍融后，常見(jiàn)解凍方法和超聲解凍均會(huì)造成羊肉脂肪氧化，其主要是由于在多次凍融中形成冰晶，會(huì)破壞肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)并釋放大量?jī)?nèi)源酶，特別是脂肪酶可加速脂質(zhì)氧化反應(yīng)，誘導(dǎo)更多的丙二醛產(chǎn)物生成[33-34]；另一方面，冰晶的形成會(huì)導(dǎo)致內(nèi)部水分的損失，增加了細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度[35]，有助于光的吸收而造成L*值降低[13]，同時(shí)內(nèi)部溶質(zhì)濃度增加也會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)氧化反應(yīng)加速[34,36]。

羊肉中脂肪氧化產(chǎn)生的自由基和過(guò)氧化物會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)造成負(fù)面影響進(jìn)而降低肉品質(zhì)[18-20]。本研究顯示羊肉在3次凍融內(nèi)TBARS值有減小趨勢(shì)，與QI等[13]將綿羊背最長(zhǎng)肌反復(fù)凍融過(guò)程中TBARS值的變化結(jié)果不同，這可能與羊肉中的脂肪氧化程度有關(guān)，前期羊肉脂肪氧化產(chǎn)物丙二醛與肉中活性氨基作用生成1-氨基-3-氨基丙烯造成TBARS值減小，而后期由于不飽和脂肪酸在氧的作用下發(fā)生氧化生成的醛和酮造成TBARS值增加[37]，說(shuō)明脂肪氧化加劇，這也與本研究PUFA含量下降的結(jié)果相一致。同時(shí)，羊肉b*值的變化也與脂質(zhì)氧化有關(guān)，細(xì)胞膜上高不飽和脂肪酸氧化生成的自由基與蛋白質(zhì)中胺類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，可能會(huì)導(dǎo)致黃色色素生成[38]，這與本研究羊肉理化特性指標(biāo)間相關(guān)分析中TBARS和b*之間存在正相關(guān)的結(jié)果相一致。因此，320 W和180 W超聲輔助解凍有利于減緩脂肪氧化，脂肪酸隨凍融次數(shù)降解較慢，特別對(duì)PUFA效果較為一致，可歸因于他們?cè)诮鈨鰰r(shí)合適的超聲波功率，可以減小超聲波解凍對(duì)原料肉品質(zhì)的負(fù)面影響，加上超聲波解凍所需解凍時(shí)間短，對(duì)蛋白質(zhì)和脂肪影響小。

3.2 超聲波輔助減少多次凍融羊肉的蛋白損失

有研究表明，多次凍融會(huì)破壞肌肉纖維結(jié)構(gòu)，降低水結(jié)合力，從而造成肉蛋白損失，營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)降低[4,21]。本研究針對(duì)性地選取第 3、7次凍融的羊肉進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)320 W功率的超聲輔助解凍處理下羊肉肌纖維結(jié)構(gòu)的完整性保持效果最好，這與前期理化特性分析的結(jié)果一致。推測(cè)主要由于超聲波具有機(jī)械作用，其機(jī)械波通過(guò)水相傳播振蕩，羊肉組織中的冰晶由于受到機(jī)械振蕩而快速破碎融化，可以減少肉品的二次傷害所致[39]；但過(guò)大的功率（400 W）也在一定程度上破壞了羊肉微觀結(jié)構(gòu)，使肌纖維保水能力下降從而造成汁液流失率升高[40]。

更重要的是，羊肉肌纖維結(jié)構(gòu)遭到破壞，引起汁液流失，會(huì)伴隨著某些氨基酸和核苷酸等風(fēng)味成分的損失，進(jìn)而導(dǎo)致解凍后肉樣的可接受程度降低[5]。本研究通過(guò)氨基酸聚類分析，發(fā)現(xiàn)超聲解凍有利于羊肉氨基酸品質(zhì)的保持，且320 W超聲功率解凍羊肉的效果最好，這主要與該功率下羊肉肌纖維結(jié)構(gòu)保持最為完整有關(guān)。但與常用解凍方法相比，超聲輔助解凍會(huì)破壞羊肉必需氨基酸組成和比例平衡，可能是由于其解凍速度快，肌肉不同蛋白質(zhì)溶解程度不一所致[41]。從更微觀的角度來(lái)看，超聲波解凍是將原料肉置于液體介質(zhì)中進(jìn)行解凍，超聲波作用于固液系統(tǒng)，氣泡由于鄰近固體表面，通常發(fā)生不對(duì)稱折疊，流體涌入氣泡中，當(dāng)邊界層被破壞時(shí)，這種效應(yīng)使固體表面熱量快速傳遞，提高解凍速率[42]；同時(shí)也能減緩解凍過(guò)程中蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，以維持蛋白質(zhì)和水分子間的作用力，從而有效避免凍融過(guò)程中鹽溶性肌原纖維蛋白溶解度下降[7,41]。另一方面，多次凍融過(guò)程引起羊肉中礦物質(zhì)及小分子蛋白質(zhì)混合物流失，可導(dǎo)致肉的離子平衡被破壞，加上宰后羊肉中糖原經(jīng)過(guò)無(wú)氧酵解產(chǎn)生乳酸，進(jìn)而造成 pH的輕微下降，蛋白質(zhì)分子的靜電荷效應(yīng)改變肌肉保水性[43-44]，這與本研究中羊肉汁液流失增加以及前期 pH降低的結(jié)果一致；而由于后期糖酵解途徑終止，羊肉蛋白質(zhì)在凍融循環(huán)過(guò)程中發(fā)生變性從而降解產(chǎn)生氨基酸，當(dāng)堿性自由氨基酸含量高于酸性自由氨基酸含量時(shí)，pH會(huì)出現(xiàn)輕微反彈[4]。此外，本研究中各組羊肉的氨基酸含量存在差異，部分氨基酸含量無(wú)明顯變化，甚至升高，這主要是由于不同凍融次數(shù)的羊肉所含水分差異造成[45]。當(dāng)然，氨基酸含量的變化也與氨基酸的自身性質(zhì)有關(guān)，比如所帶的電荷、大小等。而本研究中320 W超聲功率解凍的羊肉必需氨基酸組成和比例不佳，180 W超聲輔助解凍則能保持其組成合理和比例平衡，這種差異可能與羊肉多次凍融中不同超聲功率對(duì)肉蛋白質(zhì)發(fā)生降解程度不一致有關(guān)[46]。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)多次凍融羊肉理化特性的分析，證實(shí)羊肉經(jīng)320 W的超聲輔助解凍處理具有優(yōu)異的理化特性及品質(zhì)保持能力，其能減緩脂肪氧化，維持色澤和回復(fù)性的穩(wěn)定，特別是能降低羊肉硬度，提高肉的嫩度以改善口感。在羊肉的蛋白損失方面，320 W功率的超聲輔助解凍具有維持肌纖維結(jié)構(gòu)完整性的優(yōu)勢(shì)，能減少蛋白損失以保持羊肉氨基酸品質(zhì)。本研究系統(tǒng)證實(shí)了超聲波用于羊肉組織解凍的可行性，可為實(shí)際生產(chǎn)提供理論參考。