豬I型補體受體與C3b活性片段相互結合的體外檢測

孫雨晨，賈瑞璞，范闊海，孫娜，孫耀貴，孫盼盼，李宏全，尹偉

豬I型補體受體與C3b活性片段相互結合的體外檢測

孫雨晨，賈瑞璞，范闊海，孫娜，孫耀貴，孫盼盼，李宏全，尹偉

山西農業大學動物醫學學院，山西太谷 030801

【】檢測豬紅細胞類補體受體I型（Complement receptor 1-like，CR1-like）與C3b活性片段能否發生結合，以期為闡明豬紅細胞發揮免疫粘附功能的分子機理提供科學數據。利用前期已構建的CR1-like、CR1-like功能域片段的重組質粒建立酵母雙雜交檢測體系，運用酵母共轉化的方法將誘餌質粒（重組pGBKT7-CR1-like）與捕獲質粒（重組pGADT7-C3b）共同轉入Y2HGold酵母細胞中，分別利用一缺平板SD/-Leu、SD/-Trp和二缺平板SD/-Leu/-Trp（DDO）嚴格篩選共轉化成功的酵母細胞，再根據報告因子是否表達來鑒別轉化子在SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal（DDO/X）、SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/Aba（DDO/X/A）二缺培養板上的生長情況，并結合菌落的顏色變化現象綜合判定CR1-like活性片段與補體C3b在酵母細胞中是否發生相互結合；然后運用免疫沉淀技術分離酵母細胞中CR1-like與C3b結合復合物，并對該復合物的特異性進行Western blot鑒定。試驗成功將pGBKT7-CR1-like與pGADT7-C3b基因共轉入Y2HGold酵母細胞。共轉化的酵母克隆在SD/-Leu、SD/-Trp、DDO平板上能夠正常生長，在DDO/X、DDO/X/A平板上正常生長且菌落呈現藍色，由此表明，試驗中酵母雙雜交系統建立成功，并通過試驗獲得了陽性酵母克隆。共同轉化了pGBKT7-CR1-like和pGADT7-C3b質粒的酵母菌落PCR反向鑒定結果顯示，在共轉化的酵母菌中含有目的基因CR1-like和CR1-like，共轉化組的質粒酶切后出現C3b基因片段，與設計大小一致，說明重組質粒成功共轉化入酵母細胞中。免疫沉淀試驗中應用pGBKT7載體的標簽抗體c-Myc沉淀酵母細胞中的融合蛋白，以c-Myc為一抗進行Western blot檢測發現，單獨轉化了pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7-CR1-like(8-11)的融合蛋白在50 kD處出現特異性條帶；共轉化pGBKT7-CR1-like(3-6)+ pGADT7-C3b和共轉化pGBKT7-CR1-like(8-11)+ pGADT7-C3b的酵母融合蛋白在83 kD處出現特異性條帶；以HA單克隆抗體為一抗進行Western blot檢測時，在pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7-CR1-like(8-11)融合蛋白中沒有出現特異性條帶，只有3、4泳道中共轉化的酵母融合蛋白在83 kD處出現特異性條帶，表明在Y2HGold酵母細胞中存在CR1-like與C3b識別結合的復合物。使用CR1-like單克隆抗體沉淀酵母細胞中的融合蛋白，以CR1-like單克隆抗體為一抗進行Western blot檢測發現，單獨轉化了pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7-CR1-like(8-11)的融合蛋白在50 kD處出現特異性條帶；共轉化pGBKT7-CR1-like(3-6)+ pGADT7-C3b和共轉化pGBKT7-CR1-like(8-11)+ pGADT7-C3b的酵母融合蛋白在83 kD處出現特異性條帶；以C3單克隆抗體為一抗進行Western blot檢測發現，在pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7-CR1-like(8-11)融合蛋白中沒有出現特異性條帶，泳道3、4所示只有共轉化的酵母融合蛋白在83 kD處出現特異性條帶，表明在Y2HGold酵母細胞中存在具有生物活性的CR1-like與C3b識別結合的復合物。通過多個單克隆抗體雜交結果，可看出誘餌質粒的表達產物CR1-like、CR1-like片段與捕獲質粒的表達產物C3b片段可在酵母細胞內發生結合。豬紅細胞CR1-like發揮免疫粘附功能的識別配體為C3b，為豬紅細胞CR1-like功能域分子結構的進一步解析提供了重要數據依據。

CR1-like；C3b；酵母雙雜交；免疫粘附

0 引言

【研究意義】中國是豬肉消費和生產大國[1]，養豬業是我國農業經濟的重要支柱。近年來，豬病尤其是非洲豬瘟[2-3]、豬繁殖與呼吸系統綜合征[4]、豬流感[5]等免疫抑制性疫病的發生嚴重影響著養豬業的健康發展。先天免疫系統是豬抵抗疫病的重要防御力量，而豬紅細胞免疫是機體先天免疫防御系統的重要組成部分。因此，深入研究豬紅細胞免疫功能分子機理及其與疫病發生、發展、轉歸之間的關系對于豬病防控具有科學意義和實踐價值。【前人研究進展】人類醫學對紅細胞免疫粘附的分子基礎和機制進行了深入研究，研究結果證實紅細胞膜上的Ⅰ型補體受體（erythrocyte complement receptor 1，ECR1）是紅細胞發揮免疫粘附功能最重要的物質基礎。在CR1的介導下，紅細胞免疫功能與阿爾茲海默氏癥[6-7]、瘧原蟲感染[8-10]、慢性自身免疫性疾病[11-14]、老年性黃斑變性[15]等免疫抑制性疾病的發生發展具有密切關系。例如，CRANE等[16]研究發現Aβ在血液中形成Aβ-ICs，可以提高Aβ與補體系統中活性片段的相互作用，主要是與C1q相互結合，紅細胞的粘附以及巨噬細胞的吞噬同樣也會增加，進而提高機體對Aβ-IC的清除能力，與這些體外的結果相一致的是，在非人靈長類動物體內靜脈注射Aβ抗體形成Aβ-ICs后，血液中Aβ的清除也明顯增強。BRUBAKER等[17]進一步研究發現，獼猴的紅細胞可以免疫粘附體內的β淀粉樣蛋白，促進血液中β淀粉樣蛋白的清除，這種靈長類動物紅細胞捕獲IC的清除機制在IC沉積介導的疾病中是至關重要的。起初人們認為這種紅細胞免疫粘附受體是靈長類動物所特有的，隨著研究人員不斷的探索，發現在禽類、魚類、嚙齒類以及哺乳動物的紅細胞也具有免疫粘附功能，且與動物疫病的發生具有相關性。雞感染馬立克病病毒后，與雞紅細胞相關的多種免疫基因均發生了顯著的免疫應答，推測雞紅細胞發揮一定的免疫調控作用[18]。鄭世民等[19]研究發現雛鴨在感染了禽流感病毒后，鴨的紅細胞C3b受體花環率（red blood cell C3b receptor rate，RBC-C3bRR）對比未感染組顯著降低，而紅細胞免疫復合物花環率（red blood cell immune complex rate，RBC-ICR）則明顯升高，導致雛鴨外周血免疫功能下降。NOMBELA等[20]對感染了病毒性敗血癥出血病毒的虹鱒魚紅細胞進行檢測，發現虹鱒魚紅細胞產生了有效的抗病毒免疫反應。衛含偉等[21]用改良的保存液處理紅細胞后可通過激活HIF-1α信號通路促進糖尿病小鼠的傷口愈合。本課題組前期研究發現，豬紅細胞免疫粘附受體也是一類糖蛋白，分子量95—110 kD具有分子量多態性[22-23]，稱作紅細胞類補體受體I型（Erythrocyte complement receptor 1-like，ECR1-like）。ecr1-like通過與豬紅細胞膜蛋白4.1的相互結合而分布于豬紅細胞膜表面[24]。在ECR1-like的介導下，豬紅細胞能夠免疫粘附致敏免疫復合物，推測ECR1-like免疫粘附功能的發揮與血清C3b有關。體外研究進一步發現豬肺泡巨噬細胞能夠與粘附有致敏復合物的豬紅細胞相互作用并將致敏復合物捕獲[25]。【本研究切入點】動物紅細胞作為機體先天免疫防御的重要組成在抵抗動物疫病中發揮著重要作用。但是，動物紅細胞發揮免疫功能的分子機理尚有一些科學問題未能解決，尤其是介導動物紅細胞發揮免疫粘附功能的分子基礎尚不明了。【擬解決的關鍵問題】筆者所在的課題組綜合運用生物信息學、基因工程等技術手段成功篩出ECR1-like的第3—6功能域片段、第8—11功能域片段及豬血清C3b活性片段目標序列，并構建了捕獲載體及誘餌載體[26]。在此基礎上本試驗繼續圍繞“豬ECR1-like是否與豬血清C3b片段發生相互結合”這一科學問題開展研究，擬運用酵母雙雜交技術和免疫沉淀技術對缺省培養基篩選的陽性克隆進行鑒定，定性分析ECR1-like與C3b在酵母細胞內的識別結合關系。

1 材料與方法

本試驗于2019—2020年在山西農業大學動物醫學學院臨床獸醫學實驗室完成。

1.1 質粒與宿主菌

用于酵母細胞共轉化試驗：酵母細胞株Y2HGold、Y187（TaKaRa，中國），DH5α感受態細胞（天根，中國）。

用于酵母雜交試驗：酵母雙雜交誘餌質粒pGBKT7-CR1-like(3-6)、pGBKT7-CR1-like(8-11)（山西農業大學動物醫學學院臨床獸醫學實驗室構建）[26]。

1.2 主要試劑

用于酵母細胞共轉化試驗：E.Z.N.A.TMPlasmid Mini Kit I、E.Z.N.A.TMGel Extraction膠回收試劑盒（Omega，中國），限制性內切酶R I、I、I、H I、T4 DNA Ligase連接酶、卡那霉素、氨芐青霉素和50×TAE（Solarbio，中國），10 000×Super Gel Red核酸凝膠染料（Everbrite，美國），5 000 bp DNA Marker（中科瑞泰，中國）。

用于酵母雜交試驗：Matchmaker?Gold Yeast Two-Hybrid System酵母雙雜交試劑盒（TaKaRa，中國）。

用于酵母總蛋白提取和Western blot試驗：Yeast maker Yeast Transformation System 2、Yeast Protein Extraction Reagent酵母總蛋白提取試劑盒、Yeast Media Set 2 Plus試劑盒（TaKaRa，中國），BeaverBeads? Protein A/G Immunoprecipitation（海貍生物，中國）。

1.3 主要儀器

用于酵母細胞共轉化試驗：潔凈工作臺（博訊，中國），恒溫金屬浴（博日，中國），PCR儀（Bio-Rad，美國），核酸蛋白濃度分析測定儀（NanoDrop，美國），凝膠成像儀（Invitrogen，美國），高速冷凍離心機（Sigma，美國），超低溫冰箱（中科美菱，中國）。

用于酵母總蛋白提取和Western blot試驗：恒溫振蕩培養器（智城，中國），可調式移液器（Eppendorf，德國），數顯恒溫水浴鍋（金城國勝，中國）。

用于酵母雜交試驗：電子分析天平（Sartooeius，德國），立式壓力蒸汽滅菌器（江陰濱江，中國），生化培養箱（躍進，中國）。

1.4 CR1-like結合C3b活性片段的酵母雙雜交鑒定

1.4.1 質粒共轉化 使用Clontech公司的Yeastmaker Yeast Transformation System 2試劑盒將pGBKT7- CR1-like和pGADT7-C3b共同轉化入Y2HGold酵母感受態細胞中，主要步驟包括：取Yeast maker Carrier DNA置于95℃水浴變性3 min，然后迅速冰浴，重復3次。取1.5 mL EP管，加入Yeast maker Carrier DNA（10 mg·mL-1）5 μL、重組質粒pGBKT7-CR1-like和pGADT7-C3b各0.1 μg、Y2HGold酵母感受態細胞50 μL，輕輕混勻三者。然后加入500 μL PEG/LiAc溶液，輕輕混勻。30℃、200 r/min振蕩培養30 min。加入20 μL DMSO試劑均勻混合，置于42℃金屬浴中熱休克15 min，每5 min搖動混勻。12 000 r/min離心15 s，去上清。加入1 mL YPD Plus液體培養基重懸細胞，30℃、200 r/min振蕩培養90 min，12 000 r/min離心15 s，去上清。用1 mL 0.9% NaCl溶液重懸酵母細胞。提前配制100 mL包含Kana（50 mg·mL-1）的SD/-Trp選擇性培養基，各取200 μL菌液涂布于5個SD/-Trp選擇性平板，30℃正置30 min，再倒置培養4 d，至白色且大小均勻的克隆菌落出現。挑取單菌落于5 mL YPDA中，30℃、250 r/min培養24 h。分別收集100 μL菌液以濃度為0.9%的NaCl進行1﹕10 000稀釋，涂布于SD/-Leu、SD/-Trp、SD/-Leu/-Trp（DDO）、SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal（DDO/X）和SD/-Leu/-Trp/X-α- Gal/Aba（DDO/X/A）平板上30℃培養4 d，觀察菌落的生長情況和顏色變化。

重組質粒共轉化酵母細胞后，對共轉化組進行菌落PCR，驗證質粒是否成功轉入酵母細胞：在平板上挑取單菌落于含有10 μL超純水的EP管中，95℃變性5 min，5 000 r/min離心1 min。取上清作為PCR模板，按照前期的PCR反應體系進行[26]，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶，驗證CR1-like基因是否轉入酵母細胞中。再根據TIANprep Yeast Plasmid DNA Kit酵母質粒提取試劑盒說明書提取共轉化組的酵母質粒，按照前期的雙酶切反應體系[26]，驗證共轉酵母中是否轉入C3b基因。

1.4.2 酵母雜交 按照前期的方法將對照質粒各自轉化入對應的菌株[26]（表1）。

表1 酵母雜交

將轉化后的Y2HGold酵母細胞液涂布于SD/-Trp（50 μg·mL-1Kana）固體培養基，Y187酵母細胞液涂布于SD/-Leu（100 mg·mL-1Amp）固體培養基，30℃培養4 d。

分別挑取包含pGBKT7-53的Y2HGold酵母細胞和包含pGADT7-T的Y187酵母細胞于同一管裝有500 μL 2×YPDA培養基的1.5 mL EP管中，渦旋混勻酵母細胞，30℃，200 r/min振蕩培養24 h。取100 μL菌液用0.9%的NaCl進行1﹕10 000稀釋后，各取100 μL菌液涂布于SD/-Leu、SD/-Trp、DDO、DDO/ X/A、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/Aba（QDO/X/A）平板上30℃培養4 d，觀察菌落的生長情況及菌落的生長顏色。

陰性組處理同上。

1.5 酵母總蛋白的抽提及Western blot鑒定

1.5.1 酵母總蛋白的提取 按照Yeast Protein Extraction Reagent試劑盒的說明書提取酵母總蛋白。主要步驟包括：從轉化了pGBKT7-CR1-like(3-6)、pGBKT7-CR1-like(8-11)的酵母培養平板上分別挑取一個直徑為2 mm大小的菌落于5 mL SD/-Trp液體培養基中，共轉化了pGBKT7-CR1-like(3-6)+pGADT7-C3b、pGBKT7-CR1- like(8-11)+pGADT7-C3b的酵母細胞于DDO培養基，30℃，250 r/min振蕩培養24 h。

吸取酵母細胞培養液1 mL至1.5 mL的EP管中，8 000 r/min，4℃離心2 min，去上清；各加入1 mL 4℃預冷的超純水重懸菌體，8 000 r/min，4℃離心2 min，去上清；加入25 μL的Yeast Protein Extraction Reagent試劑，反復吹打，重懸沉淀；在30℃水浴中溫育30 min，每10 min振蕩一次；12 000 r/min，4℃離心5 min，去上清；向沉淀中加入25 μL的PBS和25 μL的2×Protein SDS PAGE Loading Buffer溶液，使沉淀重懸。

1.5.2 免疫沉淀復合物 取4個1.5 mL的EP管，標記為1、2、3、4，各加入30 μL磁珠懸液，每管中再加入200 μL結合緩沖液進行洗滌，將EP管置于磁性分離器上靜置1 min進行磁性分離，棄去上清。將EP管從磁性分離器上取下后，加入200 μL的結合緩沖液重新洗滌一次。向EP管中加入200 μL結合緩沖液重懸磁珠，分別吸取5 μL c-Myc單克隆抗體加入EP管中，置于水平搖床室溫20℃混合1 h后，置于磁性分離器上進行磁性分離，棄去上清。加入200 μL結合緩沖液再次洗滌。向1—4號EP管中依次加入200 μL的pGBKT7-CR1-like(3-6)、pGBKT7-CR1-like(8-11)、pGBKT7-CR1-like(3-6)+ pGADT7-C3b、pGBKT7-CR1- like(8-11)+pGADT7-C3b蛋白溶液200 μL，吹打混勻，置于水平搖床室溫混合1 h后進行磁性分離，棄去上清，加入200 μL洗滌緩沖液再次洗滌。最后將磁珠懸液轉移到新的EP管中，避免管壁上的抗原殘留。將新的EP管置于磁性分離器進行磁性分離，棄去上清，每管各加入50 μL的1×SDS-PAGE Loading Buffer，置于95℃金屬浴加熱5 min，磁性分離收集上清液。

另取4個1.5 mL的EP管，將其標記為a、b、c、d，磁珠預處理后按照上述操作。每管中分別加入100 μL的CR1-like單克隆抗體進行磁珠的抗體吸附處理，處理完成依次加入pGBKT7-CR1-like(3-6)、pGBKT7- CR1-like(8-11)、pGBKT7-CR1-like(3-6)+ pGADT7-C3b、pGBKT7-CR1-like(8-11)+ pGADT7-C3b蛋白溶液200 μL進行磁珠的抗原吸附處理，最后洗脫抗原，操作方法同上。

1.5.3 酵母總蛋白的Western blot檢測 按照表2、表3配制5%的濃縮膠、10%的分離膠。將膠板固定在電泳槽中，加入4℃預冷的電泳緩沖液，加樣孔中依次緩緩加入蛋白Marker 5 μL、1.5.1中提取的各蛋白樣品10 μL進行電泳，電壓設置為80V，至樣品剛跑過濃縮膠約1 h后，再調整為120V繼續電泳45 min，停止電泳。

切割出所需凝膠，裁剪好與凝膠大小一致的濾紙和PVDF膜。先將PVDF膜浸泡于甲醇中進行激活，10 s后取出放入轉膜緩沖液。將電轉的夾子黑色為底浸泡在轉膜緩沖液中，分別鋪上3層濾紙，凝膠，PVDF膜和另外的3層濾紙，四周對齊。將夾子夾緊并放入轉膜槽中，加入轉膜緩沖液，對正電極，設置電壓為60V轉膜2 h。將PVDF膜取出放入脫脂奶粉封閉液中，置于水平搖床80 r/min室溫封閉2 h。載有蛋白1—4號樣品的兩張PVDF膜分別使用c-Myc單克隆抗體（1﹕1 000稀釋）和HA單克隆抗體（1﹕800稀釋）4℃過夜孵育。載有蛋白a、b、c、d的兩張PVDF膜分別使用CR1-like單克隆抗體（1﹕300稀釋）和C3單克隆抗體（1﹕800稀釋）4℃過夜孵育。棄去一抗孵育液，用TBST洗3次每次10 min；孵育二抗，一抗為c-Myc抗體和C3抗體的膜使用二抗為羊抗兔IgG，一抗為HA抗體和CR1-like抗體的膜使用二抗為兔抗鼠IgG，TBST按1﹕10 000稀釋，37℃，80 r/min孵育1 h。用TBST洗3次每次10 min。按照高靈敏度化學發光檢測試劑盒說明書配制發光液，在PVDF膜上敷上發光液，緩慢晃動使發光液涂抹均勻，使用濾紙吸去多余發光液，用保鮮膜覆蓋，在暗室使用膠片曝光，曝光后膠片自然晾干，掃描膠片，保存圖像進行分析。

表2 配制5%濃縮膠

表3 配制10%分離膠

2 結果

2.1 質粒共轉化激活酵母細胞報告因子的鑒定

將pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGADT7-C3b共同轉入Y2HGold后，在SD/-Leu（圖1-A）、SD/-Trp（圖1-B）、DDO（圖1-C）平板均長出白色菌落，在DDO/X（圖1-D）和DDO/X/A（圖1-E）平板上菌落正常生長且變為藍色。將pGBKT7-CR1-like(8-11)和pGADT7- C3b共轉化后，出現同樣的結果，在SD/-Leu（圖2-A）、SD/-Trp（圖2-B）、DDO平板長出白色菌落（圖2-C），在DDO/X（圖2-D）和DDO/X/A（圖2-E）平板上菌落正常生長且變為藍色。說明豬CR1-like與C3b的識別結合激活了報告因子MEL1和AUR1-C。

A—E：共轉化了pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGADT7-C3b的酵母細胞在SD/-Leu、SD/-Trp、DDO、DDO/X、DDO/X/A培養板的生長情況

A—E：共轉化了pGBKT7-CR1-like(8-11)和pGADT7-C3b的酵母細胞在SD/-Leu、SD/-Trp、DDO、DDO/X、DDO/X/A培養板的生長情況

2.2 酵母雙雜交陽性對照和陰性對照培養

Y2HGold（pGBKT7-53）與Y187（pGADT7-T）進行雜交后，包含兩種質粒的酵母細胞陽性對照均可以在SD/-Trp、SD/-Leu、DDO、DDO/X/A、QDO/X/A上生長。且在DDO/X/A（圖3-D）、QDO/X/A（圖3-E）上菌落為藍色。Y2HGold（pGBKT7-Lam）與Y187（pGADT7-T）的酵母細胞二者雜交不能激活報告基因，酵母細胞只能在SD/-Trp（圖4-A）、SD/-Leu（圖4-B）、DDO上（圖4-C）正常生長，在DDO/X/A（圖4-D）、QDO/X/A上（圖4-E）不能生長，證明本試驗中酵母雙雜交系統良好。

2.3 重組質粒共轉化酵母的基因鑒定

共同轉化pGBKT7-CR1-like和pGADT7-C3b質粒的酵母菌落PCR反向鑒定結果顯示，在共轉化的酵母菌（圖5-A）中含有目的基因CR1-like和CR1-like，共轉化組的質粒酶切后出現C3b基因片段（圖5-B），與設計大小一致，說明重組質粒成功共轉化入酵母細胞中。

2.4 CR1-like識別結合C3b的檢測

使用pGBKT7載體的標簽抗體c-Myc沉淀酵母細胞中的融合蛋白，以c-Myc為一抗進行Western blot檢測發現，單獨轉化了pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7- CR1-like(8-11)的融合蛋白在50 kD處出現特異性條帶（圖6-A）。共轉化pGBKT7-CR1-like(3-6)+ pGADT7-C3b和共轉化pGBKT7-CR1-like(8-11)+ pGADT7-C3b的酵母融合蛋白在83 kD處出現特異性條帶（圖6-B）。以HA單克隆抗體為一抗進行Western blot檢測時，在pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7-CR1-like(8-11)融合蛋白中沒有出現特異性條帶，只有3、4泳道中共轉化的酵母融合蛋白在83 kD處出現特異性條帶（圖6-C）。表明在Y2HGold酵母細胞中存在CR1-like與C3b識別結合的復合物。

A—E：共轉化了pGBKT7-53和pGADT7-T的酵母細胞在SD/-Leu、SD/-Trp、DDO、DDO/X/A、QDO/X/A培養板的生長情況

A—E：共轉化了pGBKT7-Lam和pGADT7-T的酵母細胞在SD/-Leu、SD/-Trp、DDO、DDO/X/A、QDO/X/A培養板的生長情況

A：pGBKT7-CR1-like質粒的電泳圖：M1：DL2 000 DNA Maker；1：共轉pGBKT7-CR1-like(3-6)；2：共轉pGBKT7-CR1-like(8-11)。B：pGADT7-C3b質粒的電泳圖：M2：DL5 000 DNA Marker；1、2：共轉pGADT7-C3b

CR1-like單克隆抗體沉淀酵母細胞中的融合蛋白，以CR1-like單克隆抗體為一抗進行Western blot檢測發現，單獨轉化了pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7- CR1-like(8-11)的融合蛋白在50 kD處出現特異性條帶（圖7-A）。共轉化pGBKT7-CR1-like(3-6)+ pGADT7- C3b和共轉化pGBKT7-CR1-like(8-11)+ pGADT7-C3b的酵母融合蛋白在83 kD處出現特異性條帶（圖7-B）。以C3單克隆抗體為一抗進行Western blot檢測時，在pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7-CR1-like(8-11)融合蛋白中沒有出現特異性條帶，如泳道3、4所示只有共轉化的酵母融合蛋白在83 kD處出現特異性條帶（圖7-B）。表明在Y2HGold酵母細胞中存在具有生物活性的CR1-like與C3b識別結合的復合物。

M：蛋白Marker；A、B：c-Myc抗體的Western blot檢測；C：HA抗體的Western blot檢測

M：蛋白Marker；A、B：CR1-like抗體的Western blot檢測；C：C3抗體的Western blot檢測

3 討論

免疫粘附血清致敏的免疫復合物（immune complex，IC）是紅細胞最主要的免疫功能，經血清致敏的IC可被紅細胞I型補體受體（erythrocyte complement receptor 1，ECR1）通過與沉積在復合物上的C3b等補體片段結合，捕獲復合物，將其運送到肝脾后被吞噬細胞吞噬，促進體內循環IC的清除。這種紅細胞免疫粘附清除機制對阿爾茲海默氏病[27]、支原體肺炎[28]、附紅細胞體病[29]、系統性紅斑狼瘡[12]和C3腎小球病[30]等多種疾病的發生發展過程都具有影響。豬紅細胞具有免疫功能，是機體先天免疫的重要組成部分。豬紅細胞膜上存在類I型補體受體（complement receptor 1-like，CR1-like），是豬紅細胞發揮免疫粘附功能的重要分子基礎[31]。2014年，CHENG等[32]克隆出長白豬紅細胞CR1-like基因全長cDNA序列，大小為4 391 bp，包含3 996 bp的開放閱讀框，37 bp的5’-非編碼區和358 bp的3’-非編碼區，并通過生物信息學分析得出該基因位于豬的九號染色體上（GenBank，登錄號：KF 286 608），揭示了豬CR1-like蛋白是一個包含19個SCRs結構域的補體受體調控類膜糖蛋白，進一步研究顯示，豬紅細胞上CR1-like基因具有基因多態性[33]。2015年薛翼鵬[34]成功制備了小鼠抗豬CR1-like單克隆抗體，為后續研究豬紅細胞補體受體提供了試驗抗體。現已證實在體外共孵育條件下，豬紅細胞與豬肺泡巨噬細胞具有相互作用，豬肺泡巨噬細胞競爭性結合豬紅細胞表面所粘附的熒光大腸桿菌后，其形態未見病理變化但表面CR1-like數量顯著降低[35]。綜上所述，豬紅細胞表面存在CR1-like，但是CR1-like介導豬紅細胞發揮免疫粘附功能的分子機理尚不清楚，僅推測豬紅細胞CR1-like發揮免疫功能與血清C3b有關。

本試驗為了驗證CR1-like與補體C3b之間的識別結合，將pGBKT7-CR1-like(3-6)+ pGADT7-C3b和pGBKT7-CR1-like(8-11)+ pGADT7-C3b共同轉入酵母細胞Y2HGold中，檢測酵母報告因子的表達。結果發現共轉化的酵母細胞落在DDO/X和DDO/X/A平板能夠正常生長且變為藍色，說明pGBKT7-CR1-like和pGADT7-C3b表達的蛋白在酵母細胞中發生了識別結合從而激活了酵母轉錄因子GAL4，促使報告因子MEL1和AUR1-C發生轉錄，酵母細胞表達α-半乳糖苷酶和AUR1-C，使酵母在含有Aba和X-a-Gal的DDO/X/A培養板中能夠抗Aba正常生長且表現為藍色。初步證明豬pGBKT7-CR1-like(3-6)和pGBKT7- CR1-like(8-11)融合蛋白可以識別結合pGADT7-C3b融合蛋白。

本試驗使用pGBKT7載體的標簽抗體c-Myc免疫沉淀共轉化酵母蛋白中的復合物，再使用c-Myc抗體進行Western blot，以確定CR1-like識別結合C3b復合物是否存在。結果發現單獨轉化的pGBKT7-CR1- like(3-6)和pGBKT7-CR1-like(8-11)融合蛋白以及共同轉化的pGBKT7-CR1-like(3-6)+pGADT7-C3b和pGBKT7- CR1-like(8-11)+ pGADT7-C3b融合蛋白內均能檢測到特異條帶，并且條帶大小與pGBKT7-CR1-like相近（pGBKT7-CR1-like(3-6)理論大小為40 kD，pGBKT7- CR1-like(8-11)理論大小為48 kD），說明c-Myc成功沉淀出復合物。當使用pGADT7載體的標簽抗體HA為一抗進行Western blot發現，只在共轉酵母的蛋白中出現特異條帶并且與pGADT7-C3b融合蛋白的理論大小78 kD相近。對比單獨轉化pGBKT7-CR1-like的陰性對照可知，在pGBKT7載體的標簽抗體c-Myc免疫沉淀的復合物中，存在pGADT7-C3b蛋白。說明在共轉化的酵母細胞中存在CR1-like識別結合C3b的復合物。同理使用CR1-like單克隆抗體免疫沉淀復合物后，CR1-like抗體作Western blot檢測發現單轉和共轉酵母中均有CR1-like的特異條帶，條帶大小與c-Myc抗體檢測到的一致，說明CR1-like抗體成功沉淀出復合物，pGBKT7-CR1-like融合蛋白在酵母細胞中成功表達。當使用C3抗體進行Western blot檢測后，與HA抗體檢測到的結果一致，再次證明共轉化酵母細胞中存在具有生物活性的CR1-like識別結合C3b復合物。值得注意的是，在共轉化酵母蛋白的Western blot檢測中，融合蛋白的條帶分子量與pGADT7-C3b的理論值相近，并非是pGBKT7- CR1-like蛋白與pGADT7-C3b蛋白分子量的數值相加，有可能是pGBKT7-CR1-like與pGADT7-C3b之間的結合力相對較弱或結合具有可逆性，導致二者的識別結合復合物發生了分離。酵母細胞作為真菌，無法完美復制動物體內的環境，融合的GAL4結構域也有可能阻斷蛋白間相互作用的部位，僅靠酵母雙雜交單一技術手段來鑒別蛋白質之間的相互作用具有一定局限性，后期可以運用其他體內體外的相互作用技術方法如GST pull-down試驗、生物分子熒光互補技術等深入研究。

4 結論

本試驗體外條件下豬紅細胞CR1-like活性片段能夠與C3b活性片段發生結合，CR1-like結合C3b的區域位于第3—6功能域片段及第8—11功能域片段。

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SUN YuChen, JIA RuiPu, FAN KuoHai, SUN Na, SUN YaoGui, SUN PanPan, LI HongQuan, YIN Wei

College of Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi

【】In order to provide scientific data for elucidating the molecular mechanism of porcine erythrocyte immune adhesion function, it was investigated whether CR1-like (Complement receptor 1-like, CR1-like) of porcine erythrocyte could bind to the C3b or not.【】In this study, the recombinant plasmids ofCR1-likeandCR1-likefunctional domain fragments were constructed first, which were used to establish a yeast two-hybrid detection system. The bait plasmid (recombinant pGBKT7-CR1-like) and capture plasmid (recombinant pGADT7-C3b) were co-transformed into Y2HGold yeast cells. The single deficient SD/-Leu, SD/-Trp and double-deficient SD/-Leu/-Trp (DDO) media were used to strictly screen the co-transformed yeast cells. Then, according to the expression of report factor, the growth of transformants were identified on the double-deficient medium SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal (DDO/X) or SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/Aba (DDO/X/A) combined with the color change phenomenon of the colony to comprehensively determine whether CR1-like active fragments and complement C3b bind to each other in yeast cells or not. The CR1-like-C3b binding complex in yeast cells was then separated by immunoprecipitation, and the specificity of the complex was identified by Western blot. 【】The co-transformed yeast clones showed normal growth on SD/-Leu, SD/-Trp, DDO and DDO/X, DDO/X/A media with blue color colonies, and this indicated that positive yeast colonies were successfully obtained.The results of PCR reverse identification showed that the co-transformed yeast contained the target genesand. The C3b gene fragment appeared after the plasmid was digested, indicating that the recombinant plasmid pGBKT7-CR1-like and pGADT7-C3b were successfully co-transformed into yeast cells. In the immunoprecipitation test, the tag antibody c-Myc of the pGBKT7 vector was used to precipitate the fusion protein in yeast cells.Western blot detection with c-Myc as the primary antibody revealed that the fusion protein transformed pGBKT7-CR1-like(3-6)and pGBKT7-CR1-like(8-11)separately showed a specific band at 50kDa; the yeast fusion protein co-transformed with pGBKT7-CR1-like(3-6)+ pGADT7-C3b and pGBKT7-CR1-like(8-11)+ pGADT7-C3b showed a specific band at 83kDa;when the HA monoclonal antibody was used as the primary antibody for Western blot detection, no specific bands appeared in the pGBKT7-CR1-like(3-6)and pGBKT7-CR1-like(8-11)fusion proteins, and only the yeast fusion protein co-transformed in lane 3 and 4 showed a specific band at 83kD. It showed that there was a complex of CR1-like and C3b in Y2HGold yeast cells. Using CR1-like monoclonal antibody to precipitate the fusion protein in yeast cells, Western blot detection with CR1-like as the primary antibody revealed that the fusion protein transformed with pGBKT7-CR1-like(3-6)and pGBKT7-CR1-like(8-11)separately showed a specific band at 50kD;the yeast fusion protein co-transformed with pGBKT7-CR1-like(3-6)+ pGADT7-C3b and pGBKT7-CR1-like(8-11)+ pGADT7-C3b showed a specific band at 83kD;when the C3 monoclonal antibody was used as the primary antibody for Western blot detection, no specific bands appeared in the pGBKT7-CR1-like(3-6)and pGBKT7-CR1-like(8-11)fusion proteins,lanes 3 and 4 showed that only the co-transformed yeast fusion protein had a specific band at 83kD. This indicated that there was a biologically active CR1-like and C3b binding complex in Y2HGold yeast cells.The bait plasmid expression productsCR1-like,CR1-likefragments and capture plasmid expression products C3b fragment could be combined in yeast cells.【】In summary, the recognition ligand for porcine erythrocyte CR1-like to exert immune adhesion function was C3b, which provided an important data basis for the further analysis of the molecular structure of CR1-like functional domain.

CR1-like; C3b; yeast two-hybrid; immune adherence

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.19.018

2021-03-09；

2021-05-12

國家自然科學基金項目（31640082）、國家自然科學基金青年科學基金項目（31702221）、山西省研究生優秀創新項目（2019SY216）

孫雨晨，Tel：15935454178；E-mail：15935454178@163.com。通信作者李宏全，Tel：0354-6288409；E-mail：livets@163.com。通信作者尹偉，Tel：15835058784；E-mail：dkyyinwei@126.com

（責任編輯 林鑒非）