柴胡加龍骨牡蠣湯調控NF-κB信號通路對癲癇大鼠神經炎癥及海馬神經元損傷的影響

王 倩，曾 培，袁莉莉，張永玲，白永利，范文濤

(1.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中醫藥研究院，陜西 西安 710003)

癲癇(Epilepsy,EP)是大腦神經元超同步化反復異常放電所引起的以暫時性意識喪失、口吐白沫、四肢肌肉強直抽搐為主要臨床表現的一種中樞神經系統功能障礙性疾病。中國范圍內現有癲癇患者大約九百多萬人，全球平均每天新發癲癇病例大約6000例左右，且80%左右的癲癇患者生活在發展中和經濟偏于落后的國家和地區，由于受到經濟和醫療條件的限制很多癲癇患者并未得到全面的治療[1]。

前期研究發現，癲癇的發病可能是NF-κB信號通路、炎癥因子共同作用的結果[2]。本文研究柴胡加龍骨牡蠣湯對NF-κB信號通路的影響，為明確柴胡加龍骨牡蠣湯治療癲癇的作用機制提供分子生物學支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 西安交通大學實驗動物中心購買SPF級健康SD雄性大鼠60只，鼠的年齡25～26周，體重為180～220 g左右，動物許可證號:SCXK(陜)2017-003。購買后的大鼠需要適應性飼養1周，自由飲水與進食，室溫(21±2)℃，濕度40%～50%，1周后進行相關動物實驗。

1.2 實驗藥品、試劑 硫酸阿托品注射液、丙戊酸鈉片、毛果蕓香堿、氯化鋰、IL-6/TNF-α ELISA試劑盒、HE染色試劑盒、β-actin、NF-κBp65兔多克隆抗體、BCA蛋白測定試劑盒。

1.3 動物分組與造模

1.3.1 分組：采用隨機數字表法選取SPF級SD成年大鼠60只，然后隨機將大鼠分成六組，分別設為空白組、模型組、丙戊酸鈉組和柴胡加龍骨牡蠣湯高、中、低劑量組，每組大鼠有10只，且均為雄性SD大鼠。

1.3.2 顳葉癲癇大鼠造模：將氯化鋰注射液調配成127 mg/kg，每只大鼠進行稱重記錄，然后行腹腔注射，記錄時間，注射完氯化鋰后間隔18～24 h，再給予1 mg/kg阿托品腹腔注射，以抑制匹羅卡品注射后大鼠出現的外周膽堿能反應。30 min后開始按32 mg/kg的比例給予匹羅卡品腹腔注射，注射完藥物后，將大鼠放入籠中，密切觀察每只大鼠的反應。大約5 min左右大鼠陸續出現嘴角流涎、吐白沫、鼓腮、不斷撓胡須、眼球充血流血淚等癥狀，部分大鼠開始出現面部頻繁抽動，四肢強直顫栗抖動，甚則雙上肢出現直立、頭后仰、旋轉、摔倒等，如Racine發作等級標準表中的發作癥狀(0級：沒有癲癇發作的任何癥狀；Ⅰ級：胡須抖動，鼓腮，面部時有抽搐；Ⅱ級：全身陣攣性抽動，口角流涎，節律性點頭，背部毛濕潤；Ⅲ級：同Ⅱ級，出現上肢站立性抖動；Ⅳ級：全身陣攣性抽搐，后肢直立；Ⅴ級：反復跌倒，全身肌肉強直，抽搐頻繁)。大鼠癲癇發作等級達到Ⅳ級及以上，且發作時間持續30 min以上者則為癲癇模型成功，沒有達到以上發作級別和發作時間的，則表明造模沒有成功，需按10 mg/kg匹羅卡品量每間隔30 min追加1次，連續追加3次仍未達到以上發作級別和時間要求者，則為造模失敗，予以剔除。造模過程中有3只發作級別沒有達到Ⅳ級或Ⅳ級以上，予以剔除，造模過程中因癲癇大發作死亡5只，模型成功大鼠給予30 mg/kg水合氯醛以緩解癲癇大發作的痙攣狀態，在注射水合氯醛過程中有2只大鼠死亡，可能與水合氯醛注射過量有關。造模成功后比較虛弱的大鼠，每只給予3 ml葡萄糖氯化鈉注射液進行營養支持治療，每天分早晚2次，連續給予3 d。每組大鼠給予常規飼料喂養，正常飲水。

1.4 藥物及給藥方法

1.4.1 柴胡加龍骨牡蠣湯：柴胡12 g，龍骨、生姜、黨參、桂枝、茯苓、牡蠣各4.5 g，半夏10 g，黃芩3 g，大黃6 g，大棗6枚(原方中有鉛丹，但因鉛丹有毒，所以方中未加鉛丹)。煎藥方法：將龍骨、牡蠣放入先煎30 min，然后再加入剩余藥物，武火煮沸，文火再煎25 min，共煎2次，將兩次所煎藥物混合在一起，待藥物冷卻以后放入4 ℃冰箱備用。每次灌胃前將藥物倒出一定的量，放入溫水中加熱。

1.4.2 給藥方法與劑量：空白組與模型組每天給予相同劑量的0.9%氯化鈉灌胃治療，0.9%氯化鈉劑量為10 ml/kg，1次/d。丙戊酸鈉組：每天給丙戊酸鈉組1.6 mg/kg體重，溶于2.5 ml0.9%氯化鈉灌胃，1次/d。柴胡加龍骨牡蠣湯組：每天給予按生藥18、9、4.5 g/kg體重溶于2.5 ml0.9%氯化鈉灌胃，1次/d，分為柴胡加龍骨牡蠣湯高、中、低劑量組。灌胃療程為4周，模型復制成功后，從造模成功后第2天開始進行中藥灌胃干預療法，連續灌胃4周。

1.5 指標檢測及方法

1.5.1 大鼠行為學:造模成功后和治療期間觀察各組大鼠癲癇發作的頻率、次數和每次發作的持續時間，進食情況同時測量大鼠體重的變化。

1.5.2 海馬組織HE染色:將海馬組織浸泡在4%的多聚甲醛中24 h后，取出用清水水洗，依次放入梯度酒精和二甲苯中脫水過夜15 h、脫水后取出用石蠟進行包埋，將包埋后的組織取出，用切片機切成厚約3 μm的薄片，放入恒溫池中，再用載玻片進行撈片，烘烤1 h左右。按照HE染色步驟進行。

1.5.3 TNF-α、IL-6 按照ELISA及Western blot實驗步驟進行。

2 結 果

2.1 大鼠一般行為學變化 空白組大鼠每日正常進食飲水，較活躍，呈聚集式圍攏在一塊，毛色光亮，大便致密呈顆粒狀；造模組大鼠1周內，每日癲癇發作較頻繁，發作時上肢直立、口吐涎沫、全身肌肉痙攣抽搐甚則向后顛倒，眼球怒睜，易激惹狀，毛發豎立呈“濕狗狀”、大鼠之間容易發生撕咬現象，發作結束后精神萎靡，進食飲水也較空白組大鼠減少，大便稀溏，體重明顯減輕；治療組經每日柴胡加龍骨牡蠣湯和丙戊酸鈉灌胃治療2周后，每日癲癇發作的級別、時間、程度、進食飲水情況、體重等都有所改變；其中高劑量組癲癇發作次數減少較明顯，每日發作的級別和程度都有所減少，進食飲水明顯增加，體重逐漸增加；丙戊酸鈉組和中劑量組大鼠每日癲癇發作次數、發作級別和發作時間也較灌胃前相比有所減少，進食飲水有所增多，體重有所增加；小劑量組大鼠每日癲癇發作次數和級別與灌胃治療前相比有所減少，進食增多，體重也有所增加。

2.2 各組大鼠體重變化 在造模后和灌胃治療期間每日對各組大鼠體重進行稱重并記錄，造模前，各組大鼠體重之間的比較差異無統計學意義。灌胃治療2周后，造模后各組大鼠體重明顯低于空白組(P<0.05或0.01)，柴胡加龍骨牡蠣湯高劑量組、中劑量組及丙戊酸鈉組大鼠體重明顯高于模型組(P<0.01)，柴胡加龍骨牡蠣湯中劑量組、低劑量組大鼠體重明顯低于高劑量組(P<0.05或0.01)，丙戊酸鈉組大鼠體重明顯高于柴胡加龍骨牡蠣湯低劑量組(P<0.05)；灌胃治療4周后，造模后各組大鼠體重明顯低于空白組(P<0.01)，柴胡加龍骨牡蠣湯高劑量組、中劑量組、低劑量組及丙戊酸鈉組大鼠體重明顯高于模型組(P<0.01)，柴胡加龍骨牡蠣湯中劑量組、低劑量組及丙戊酸鈉組大鼠體重均明顯低于高劑量組(P<0.05或0.01)，丙戊酸鈉組大鼠體重明顯高于柴胡加龍骨牡蠣湯低劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體重變化(g)

2.3 各組大鼠海馬組織病理學改變 HE染色結果顯示：空白組大鼠海馬結構中顆粒細胞和錐體細胞分布均勻、層次分明、細胞之間的排列也比較緊密、飽滿，胞漿透明顏色淡紅，胞核呈橢圓形分布；模型組大鼠海馬細胞腫脹、輪廓分布不均，細胞數量減少，細胞核破碎，出現細胞凋亡現象；與模型組相比，中藥高、中、低劑量組和丙戊酸鈉組顆粒細胞和錐體細胞數量較多，形態完整、邊界清晰，分布較緊密(圖1)。

2.4 各組大鼠血清炎癥因子白介素6(IL-6)以及腫瘤壞死因子(TNF-α)表達情況 灌胃治療4周后，抽取各組大鼠血清采用ELISA法測定IL-6和TNF-α水平，實驗結果顯示：與空白組相比，造模后各組大鼠血清中IL-6 及TNF-α水平均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，柴胡加龍骨牡蠣湯高、中組和丙戊酸鈉組的IL-6和TNF-α表達均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)，與柴胡加龍骨牡蠣湯高劑量組相比，中劑量組和低劑量組IL-6和TNF-α水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)，與柴胡加龍骨牡蠣湯中劑量組相比，低劑量組IL-6和TNF-α水平均明顯升高，丙戊酸鈉組IL-6和TNF-α水平均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)，與柴胡加龍骨牡蠣湯低劑量組相比，丙戊酸鈉組IL-6和TNF-α均水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

A：空白組；B：模型組；C：高劑量組；D：中劑量組；E：低劑量組；F：丙戊酸鈉組

表2 各組大鼠血清IL-6和TNF-α表達情況

2.5 各組癲癇大鼠海馬組織NF-κBp65與IκBa蛋白表達情況 灌胃治療4周后，剝離各組大鼠海馬組織，采用Western blot法測定NF-κBp65、IκBa相對表達水平。結果顯示：與空白組比較各組大鼠IκBa相對表達水平均明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較高劑量組、中劑量組、低劑量組與丙戊酸鈉組IκBa相對表達水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)(圖2) 。與空白組比較各組大鼠NF-κBp65相對表達水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較高劑量組、中劑量組和丙戊酸鈉組NF-κBp65相對表達水平均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。NF-κBp65、IκBa蛋白表達在高劑量組、中劑量組、低劑量組與丙戊酸鈉組之間比較，無統計學差異(P>0.05)(圖3、4)。

注：與空白組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

注：與空白組比較，▲▲P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖4 各組大鼠海馬IκBa、NF-κBp65蛋白電泳圖

3 討 論

癲癇是一種突發性，短暫性大腦神經功能失調的疾病，以突然撲倒，兩目上視，口吐涎沫，口中發出豬羊叫聲，甚則昏不知人的一種發作性疾病。中醫認為本病的病機與突受驚恐、痰濁阻竅、血瘀、氣機郁滯等有關。治法多以行氣開郁，化痰逐瘀，鎮心安神為主。裴新軍[3]認為柴胡加龍骨牡蠣湯治療癲癇的機理與通膽腑調氣機有關，膽與心腦相通，膽屬陽木，肝與膽相表里，可以疏調人體氣機，柴胡加龍骨牡蠣湯以小柴胡湯為基礎，可以疏調少陽氣機，氣機調暢，風火痰瘀等病理產物也會隨之消失，癲癇就會隨之緩解。

中醫對癲癇的認識及柴胡加龍骨牡蠣湯應用：柴胡加龍骨牡蠣湯出自《傷寒論》卷三辨太陽病脈證并治第107條：“傷寒八九日，下之……柴胡加龍骨牡蠣湯主之。”其中煩驚和譫語屬于神志方面的表現，因此認為柴胡加龍骨牡蠣湯具有安神定志，調達氣機的作用。本方可以看作由小柴胡湯減去甘草，加入鉛丹、桂枝、茯苓、大黃、龍骨、牡蠣而成。方中柴胡舒達少陽氣機，作為方中君藥，人參與半夏為臣藥補益中焦脾胃之氣，并具有降逆止嘔的作用，龍骨、牡蠣、鉛丹等質重潛降之品，以斂上亢之虛陽，茯苓利小便以通陽氣，大黃通大便以瀉瘀熱，起到釜底抽薪的功效，桂枝通陽解肌發表以除身重，生姜、大棗調和陰陽，以祛在表之邪氣。本方具有調少陽樞機，鎮心安神，泄熱通腑的功效。《難經·二十難》中認為癲證以陰證和虛證為主，而狂證則以陽熱實證為多見。但是隨著病情的變化，癲證日久也可轉化成狂證，狂證也可轉為癲證，所以兩者常常同稱。癲狂多由先天稟賦不足，情志不遂氣機運行受阻而引起的臟腑功能逆亂阻塞腦竅，相當于現代醫學說的精神分裂癥。狂證多為痰火擾神所致，治療以瀉火滌痰為主，癲病多屬于氣滯痰結血瘀蒙蔽心竅所致，治法以行氣解郁，化痰開竅為要。柴胡加龍骨牡蠣湯可以看成是以小柴胡湯為底方來條暢少陽經之氣機加桂枝溫陽通絡，以助膀胱氣化，茯苓健脾利濕以行水，龍骨、牡蠣蟄藏閉澀之性，安神定驚使本方泄中有斂，以防疏泄太過之弊端，鉛丹體重而性沉降，善入血分，有墜痰去怯的功效，故多用于治療驚癇癲狂類疾病，大黃泄熱通瘀，以止譫語，諸藥同用具有疏解少陽，通陽泄熱，鎮心安神的功效，用于治療陰陽逆亂，痰濁內阻，神志錯亂之癥，如癲狂、癲癇、不寐、郁證等神志性疾病。《經驗選秘》中提到：“凡癡癲、羊癲風等癥，皆痰迷心竅所致”，肺為貯痰之器，脾為生痰之源，腎為生痰之本[4]。癲癇是由于風、火、痰、驚、瘀、郁、虛上擾所致，臟腑失調從而造成血行失循、氣血虧損，可累及肝、脾、腎。臨床以健脾益氣、養心安神、化痰、補益肝腎為治理之契機[5]。顏彥武等[6]使用藥物貼服肚臍的方法，激發、疏通經絡，調和氣血，從而調節患兒臟腑的陰陽平衡，最終達到改善腦癱兒童的預后。

柴胡加龍骨牡蠣湯現代藥理學研究：柴胡加龍骨牡蠣湯臨床應用較廣泛，多用于治療癲癇、焦慮、抑郁、失眠等神志疾病[7]。現代藥理研究發現柴胡加龍骨牡蠣湯具有鎮驚、催眠、抗抑郁、降血脂、防止動脈粥樣硬化等作用[8]。馬喜鳳等[9]認為癲癇的發病與心、肝、脾三臟關系較為密切，臨床用柴胡加龍骨牡蠣湯合經驗方平癇湯(郁金、丹參、代赭石、天麻、僵蠶、石菖蒲)治療癲癇效果較佳。梅國強教授[10]以柴胡加龍骨牡蠣湯為基礎方加減治療1例繼發性癲癇患者，經兩個月治療后癲癇發作癥狀得到了完全控制。金杰教授[11]認為癲癇的發病與情志刺激影響少陽樞機有關，臨床治療由情志刺激所引起的癲癇多用疏肝利膽法，選用柴胡加龍骨牡蠣湯加減來條暢少陽氣機效果較好。史金玉等[12]通過冠狀動脈前降支結扎法建立小鼠心肌梗死合并焦慮模型，中藥組小鼠給予柴胡加龍骨牡蠣湯灌胃治療，結果表明柴胡加龍骨牡蠣湯可以調控NF-κB信號通路，降低IL-1β、TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達，從而改善心肌梗死小鼠的心肌損傷程度。鄒梅[13]將癲癇患者隨機分為加味組和對照組，分別給予加味柴胡加龍骨牡蠣湯合愈癇丸、愈癇丸口服治療，治療結果顯示加味組優于對照組，有效率達93.8%。王倩等[14]實驗研究發現加味柴胡加龍骨牡蠣湯可以顯著降低戊四唑致癇大鼠的癲癇發作級別和發作時間，且與用藥劑量呈正相關。單萍等[15]將小鼠分為對照組、模型組、中藥大中小劑量組五組，并建立慢性癲癇小鼠模型，中藥大中小劑量組分別給予柴胡加龍骨牡蠣湯20、10、5 ml/kg灌胃治療7 d，實驗結果表明柴胡加龍骨牡蠣湯對癲癇小鼠腦組織具有保護作用。癲癇的耐藥性與多藥耐藥基因(MDR1)編碼的糖蛋白(Pgp)密切相關，癇性發作后導致血腦脊液屏障功能暫時受損，充當第二道屏障，同時也將抗癲癇藥物泵出細胞外，降低了藥效[16]。癲癇的反復發作常會導致腦神經組織損傷而損傷神經元，嚴重者可導致認知功能障礙的發生[17]。癲癇患者往往伴有抑郁和焦慮，而抑郁和焦慮又進一步降低了癲癇患者的生活質量，增加了癲癇發作頻次[18]。

柴胡加龍骨牡蠣湯對癲癇大鼠血清炎癥因子IL-6、TNF-α的影響：癲癇在發生和發展的過程中，大腦因為過度驚厥會出現缺氧、水腫等情況，缺氧和水腫的神經元及神經膠質細胞會不斷的產生炎癥因子，炎癥因子又會導致神經元興奮性增高，進一步加劇癲癇發作。炎癥因子既是癲癇產生的產物，又是引起癲癇反復發作的病理影響因素。IL-6由星膠質細胞產生，TNF-α由小膠質細胞釋放，IL-6和TNF-α能夠破壞血腦屏障，引起大量炎癥因子和細胞進入腦內，下調癲癇的發作閾值，引起癲癇發作。李國興[19]將65例癲癇患者分成原發性48例，繼發性17例，另選取30名健康者作為對照組，用ELISA法檢測患者血清和腦脊液中TNF-α變化，發現癲癇患者血清和腦脊液中TNF-α含量均明顯增高，因此認為TNF-α為癲癇發生過程中海馬硬化的主要誘導因子。劉亞東等[20]用青霉素注射的方法制造癲癇大鼠模型，造模后用柴胡加龍骨牡蠣湯灌胃治療，治療結束后對腦中SOD等含量進行測定,結果發現柴胡加龍骨牡蠣湯能降低癲癇大鼠腦中氧自由基含量，保護受損神經元，發揮抗癲癇作用。故本次實驗選用IL-6和TNF-α作為癲癇炎癥指標，治療結果顯示，與模型組相比，柴胡加龍骨牡蠣湯高、中劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-6 表達均有明顯下降，差異有統計學意義；高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6表達下降明顯，治療效果優于中、低劑量，差異有統計學意義。表明柴胡加龍骨牡蠣湯治療癲癇的機制與降低癲癇大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6的表達有關。

柴胡加龍骨牡蠣湯對癲癇大鼠海馬NF-κBp65、IκBa蛋白表達的影響：在癲癇的發作過程中，會因為各種致癇因子入侵大腦損傷血腦屏障、促使膠質細胞、神經元興奮性增加，大量分泌IL-6、TNF-α、IL-1β，進而影響到NF-κB、COX-2等下游炎癥通路，基因組穩定性減弱，血管內皮異常增生，加速神經元凋亡和苔蘚纖維發芽的進展過程。NF-κB參與了癲癇的炎癥進展過程，IκB作為NF-κB的抑制蛋白，多數情況下，與NF-κB形成異源三聚體成分存在于細胞核中，一旦刺激和損傷影響到神經元，IκB會出現磷酸化并發生蛋白水解，NF-κB與IκB解離并發生易位從而激活下游炎癥因子。周燕利等[21]將60只小鼠造癲癇模型，隨機分為對照組、模型組、治療組各20只，對照組給予0.9%氯化鈉注射，治療組給予姜黃素注射，治療結束取材后用Western blot檢測TLR4、NF-κB蛋白，結果顯示：與模型組相比，治療組TLR4、NF-κB蛋白顯著下降，說明TLR4/NF-κB信號通路參與了癲癇的發展過程中，姜黃素注射可以調控TLR4/NF-κB信號通路減輕癲癇的發作次數和頻率。本次實驗也選取了NF-κB作為柴胡加龍骨牡蠣湯治療癲癇的信號通路，實驗結果證明，癲癇發作時，大鼠腦內NF-κBp65蛋白表達增高，IκBa蛋白表達降低，通過柴胡加龍骨牡蠣湯灌胃治療后，NF-κBp65蛋白表降低，IκBa蛋白表達增高，且柴胡加龍骨牡蠣湯高劑量治療效果優于中、低劑量，差異具有統計學意義，說明柴胡加龍骨牡蠣湯可以通過調控NF-κB信號通路治療癲癇。

本文探討了柴胡加龍骨牡蠣湯對癲癇大鼠NF-κB信號通路的影響，觀察了柴胡加龍骨牡蠣湯對炎癥因子IL-6、TNF-α的表達，分析了炎癥在癲癇發作過程中的作用，為癲癇的發病機制及治療思路提供依據。