消朦靈方在糖尿病視網膜病變大鼠中的應用價值

冀 杰，羅艷華，孔 寧，林斌武

(1.廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣東 廣州 510000；2.廣州市番禺中心醫院，廣東 廣州 511400)

資料顯示，全世界范圍內糖尿病患者高達4.25億人，國內糖尿病患者高達1.14億人，隨著糖尿病患者的增加糖尿病視網膜病變的發病率也急劇增加，該病會導致盲性眼病，給患者、家庭及社會帶來了沉重的負擔[1-2]。目前，治療糖尿病視網膜病變的主要方法包括玻璃體切割術和激光光凝術，但上述治療方法會損傷患者的視力，且給患者視力帶來不適感，具有一定的局限性[3-4]。故研究有效的治療糖尿病視網膜病變的藥物尤為重要。中醫藥防治糖尿病視網膜病變已成為中醫眼科領域研究的熱點[5]，消朦靈方是臨床常用于治療視網膜病變的中藥方劑，具有益氣養陰、活血明目的功效，但其治療糖尿病視網膜病變的具體機制尚不清楚。基于此，本研究將探討消朦靈方在糖尿病大鼠視網膜病變中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：由動物實驗中心提供的75只8周齡雄性SD大鼠，體重180～220 g，動物合格證號：0020829。飼養于動物實驗中心，保持空氣流通，溫度為25～27 ℃，12 h光照維持，給予充足的飼料與水。本動物實驗研究已經過動物實驗倫理委員會批準。

1.1.2 藥物及試劑：購自美國Slgma公司生產的鏈尿佐菌素；購自胱化學試劑廠生產的檸檬酸鈉和檸檬酸；購自美國雅培公司生產的血糖試紙；購自北京中杉金橋公司生產的GAPDH內參；購自瑞士羅氏公司7600型全自動生化分析儀；購自江蘇酶免公司生產的白細胞介素6(Interleukin 6，IL-6)、血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、白細胞介素1β(Interleukin 1β，1L-1β)及腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯免疫吸附法試劑盒；購自福州飛凈生物科技公司生產的蘇木素伊紅試劑盒；消朦靈方組成：黨參、瓦楞子、毛冬青各30 g，麥冬15 g，五味子5 g，田七3 g。由我院中藥方提供。取上述藥材后用4500 g水浸泡45 min，用武火煮沸，文火煮30 min，取藥液備用；用1500 g水進行2次煎煮，20 min后與第一藥液混合，濃縮，獲得含生藥量2 g/ml的溶液。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模：75只大鼠隨機取15只為空白組，采用標準飼料喂養。剩余60只大鼠采用高脂飼料(66.5%標準飲食，2.5%膽固醇，1.0%膽汁酸，20%蔗糖，10%豬油)，1周后，對其空腹血糖進行測量，并稱體重，建立糖尿病模型(采用一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素50 mg/kg)。注射72 h后對大鼠空腹血糖進行測定，以大鼠空腹血糖≥16.7 mmol/L為高血糖大鼠，本研究中60只大鼠均造模成功。造模成功后繼續高脂高糖飲食喂養1個月，至大鼠出現胰島素抵抗、高血糖則為構建糖尿病大鼠模型成功。糖尿病大鼠造模成功后繼續高脂高糖飲食喂養1個月，直至大鼠出現視網膜病變，則為糖尿病視網膜病變大鼠造模成功。糖尿病視網膜病變大鼠模型評價：隨機取6只大鼠禁食1晚后，對空腹胰島素、血糖及葡萄糖耐量進行檢測，出現胰島素抵抗，空腹血糖≥11.1 mmol/L，且行HE染色，大鼠視網膜發生視網膜病變，則為造模成功。

1.2.2 分組及給藥方法：隨機將60只糖尿病視網膜病變大鼠分為高劑量組、中劑量組、低劑量組及模型組，每組15只，各組根據人與動物表面積折算法按照6.8、3.4、1.7 mg/(kg·d)灌胃，空白組以0.9%氯化鈉溶液灌胃，模型組以溫開水灌胃，連續給藥2個月。

1.3 實驗指標

1.3.1 體重及血糖測量：每日7∶30測量大鼠體重及空腹血糖。

1.3.2 生化指標及IL-6、VEGF、1L-1β、TNF-α水平測定：取60 mg/kg戊巴比妥鈉進行腹腔麻醉后，將完整眼球摘除，剪下角膜，分離晶狀體、玻璃體，再將視網膜分離。取一半視網膜組織制成勻漿后離心，取上清液分成2份，1份采用全自動生化分析儀檢測高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL-C)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein，LDL-C)、甘油三酯(Triglycerides，TG)及總膽固醇(Total cholesterol，TC)；另一份采用酶聯免疫吸附法對IL-6、VEGF、1L-1β及TNF-α水平進行測定。另一部保存于40 g/L甲醛溶液中備用。

1.3.3 檢測細胞凋亡指數：沖洗、固定視網膜組織，石蠟包埋切片，洗脫后，沖洗，置于超純水中，孵育15 min，洗滌2次(超純水)。加入TUNEL反應液，黑暗孵育1 h，沖洗2次，封片。熒光顯微鏡下觀察，細胞凋亡：發射波長535 nm、激發波長552 mm下顯綠色熒光細胞。隨機取8個視野計數，對凋亡指數進行計算后，各組取平均值。凋亡指數(%)=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.3.4 視網膜組織血管生成素-1(Angiopoietin-1，Ang-1)、VEGF及血管內皮細胞生長因子受體2(Vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)蛋白表達水平采用Western blot檢測：取RIPA裂解液對視網膜組織進行裂解后提取總蛋白，蛋白濃度采用BCA蛋白濃度檢測。經10% SDS-PAGE凝膠對每組50 μg蛋白上樣量進行電泳分離，轉膜，封閉，洗膜，孵育過夜，洗膜后，采用ECL化學發光發檢測，拍照，內參為β-actin，借助Image J分析軟件對各組的視網膜組織中的Ang-1、VEGF及VEGFR2蛋白表達水平進行計算。

1.3.5 視網膜組織Ang-1、VEGF及VEGFR2表達水平采用qRT-PCR法檢測：視網膜組織總RNA采用Trizol法提取，其水平采用酶標儀檢測，逆轉錄總RNA得到cDNA，Ang-1、VEGF及VEGFR2表達水平均采用SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR法檢測。由上海生工公司設計合成的引物。Ang-1、VEGF及VEGFR2上游依次為5’-TAAATCAAACATCCCTCTT-3’、5’-CCTGGCTTACTGCTGTACCT-3’、5’-GCCGGCATGGTCTTCTGTGAG-3’；Ang-1、VEGF及VEGFR2下游依次為5’-AGGTGTCCAGCTCTTCCT-3’、5’-GCTGGTAGACGTCCATGAACT-3’、5’-GGGGCTCACGGACCACATCATCTAA-3’。反應條件：95 ℃預變性5 min及變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，連續40個循環，再次72 ℃延伸10 min。根據2-△△Ct法計算Ang-1、VEGF及VEGFR2表達量，上述樣本量需檢測3次。

2 結 果

2.1 各組體重和血糖比較 見表1。造模前，各組體重及血糖水平比較，差異無統計學意義(均P>0.05)；造模成功后第1天，高劑量組、中劑量組、低劑量組及模型組的體重低于空白組，血糖高于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)；治療后，各組體重比較，差異無統計學意義(P>0.05)；空白組、高劑量組血糖水平低于中劑量組、低劑量組及模型組，中劑量組血糖水平低于低劑量組及模型組，低劑量組血糖水平低于模型組，差異有統計學意義(均P<0.05)；高劑量組血糖水平與空白組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 各組生化指標水平比較 見表2。治療后，高劑量組、空白組HDL-C、LDL-C、TG及TC水平均低于中劑量組、低劑量組及模型組，中劑量組HDL-C、LDL-C、TG及TC水平低于低劑量組及模型組，低劑量組HDL-C、LDL-C、TG及TC水平均低于模型組，差異有統計學意義(均P<0.05)；高劑量組HDL-C、LDL-C、TG及TC水平與空白組比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。

2.3 各組IL-6、1L-1β及TNF-α水平比較 見表3。治療后，高劑量組、空白組IL-6、1L-1β及TNF-α水平均低于中劑量組、低劑量組及模型組，中劑量組IL-6、1L-1β及TNF-α水平低于低劑量組及模型組，低劑量組IL-6、1L-1β及TNF-α水平低于模型組，差異有統計學意義(均P<0.05)；高劑量組IL-6、VEGF、1L-1β及TNF-α水平與空白組比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。

表1 各組體重和血糖比較

表2 各組生化指標水平比較(mmol/L)

表3 各組IL-6、1L-1β及TNF-α水平比較(pg/ml)

2.4 各組Ang-1、VEGF及VEGFR2蛋白表達水平比較 見表4。治療后，高劑量組、空白組Ang-1、VEGF及VEGFR2蛋白表達水平均低于中劑量組、低劑量組及模型組，中劑量組Ang-1、VEGF及VEGFR2蛋白表達水平低于低劑量組及模型組，低劑量組Ang-1、VEGF及VEGFR2蛋白表達水平低于模型組，差異有統計學意義(均P<0.05)；高劑量組Ang-1、VEGF及VEGFR2蛋白表達水平與空白組比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。

2.5 各組Ang-1、VEGF及VEGFR2 mRNA水平比較 見表5。治療后，高劑量組、空白組Ang-1、VEGF及VEGFR2 mRNA水平均低于中劑量組、低劑量組及模型組，中劑量組Ang-1、VEGF及VEGFR2 mRNA水平低于低劑量組及模型組，低劑量組Ang-1、VEGF及VEGFR2 mRNA水平低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)；高劑量組Ang-1、VEGF及VEGFR2 mRNA水平與空白組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表4 各組Ang-1、VEGF及VEGFR2蛋白表達水平比較

表5 各組Ang-1、VEGF及VEGFR2 mRNA水平比較

2.6 各組細胞凋亡情況比較 見表6(圖1)。各組比較治療后，高劑量組、空白組細胞凋亡指數均低于中劑量組、低劑量組及模型組，中劑量組細胞凋亡指數低于低劑量組及模型組，低劑量組細胞凋亡指數低于模型組，各組比較差異均有統計學意義(P<0.05)；高劑量組細胞凋亡指數高于空白組，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

表6 各組細胞凋亡情況比較

圖1 TUNEL染色法檢測各組大鼠細胞凋亡(TUNEL染色，×400)

3 討 論

在中醫學中將糖尿病視網膜病變歸屬于“消渴目病”的范疇[6]，古籍可見《秘傳證治要訣·三消》曰：“三清久之，精血既虧。或目無視，或手足偏廢如風疾”。由此可得出該病之本為陰虛燥熱、脾虛氣弱，血瘀貫穿始終，屬于本虛標實、虛實夾雜之證。故治則為益氣養陰、化瘀通絡。消朦靈方方中黨參歸脾、肺經，能夠補中益氣、健脾益肺，養血生津；瓦楞子歸肺、胃、肝經，可補脾益氣、滋咳潤肺、緩急解毒、調和百藥；毛冬青歸肺、肝、大腸經，可清熱解毒、活血通脈；麥冬歸肺、心、胃經，可養陰潤肺，益胃生津，清心除煩；五味子歸肺、腎、心經，可斂肺滋腎、生津斂汗、澀精止瀉、寧心安神；田七歸肝、胃經，可化瘀止血、活血定痛。諸藥合用共奏益氣養陰、活血化瘀、通脈散結明目之功效。

李錦等[7]通過的研究指出，中藥方劑聯合針刺治療非增殖性糖尿病視網膜病變有顯著的療效。程艷春等[8]的研究也指出，中藥方劑能夠降低單純型糖尿病視網膜病變患者血糖水平，改善患者臨床癥狀，效果顯著。本研究結果顯示，造模成功后第1天，高劑量組、中劑量組、低劑量組及模型組的體重低于空白組，血糖高于空白組；治療后，空白組、高劑量組血糖及生化指標水平低于中劑量組、低劑量組及模型組，中劑量組血糖及生化指標水平低于低劑量組及模型組，低劑量組血糖及生化指標水平低于模型組，提示消朦靈方能夠有效降低糖尿病大鼠視網膜病變血糖及生化指標水平，且與劑量密切相關。

IL-1β屬于多效性細胞因子，對星形膠質細胞和小膠質細胞具有激活作用，致使糖尿病視網膜病變的神經炎性反應和進行性神經緣與血管變性[9]。TNF-α是重要的炎癥因子之一，主要由活化的單核細胞和巨噬細胞產生，能夠增加局部炎癥反應，誘導血管內皮細胞釋放凝血因子及啟動凝血過程等作用。在增殖性糖尿病視網膜病變患者中的纖維血管膜浸潤細胞、視網膜血管內皮細胞及細胞外基質中存在有大量的TNF-α，其能夠誘導新血管生成。其水平越高表示糖尿病視網膜病變患者的預后不佳[10-11]。IL-6是一種多功能細胞因子，能夠誘導血管內皮生長因子，促使其形成新的血管，導致血管滲透性增加，進而誘發糖尿病視網膜病變[12]。本研究結果顯示，治療后，高劑量組、空白組IL-6、VEGF、1L-1β及TNF-α水平均低于中劑量組、低劑量組及模型組，中劑量組IL-6、VEGF、1L-1β及TNF-α水平低于低劑量組及模型組，低劑量組IL-6、VEGF、1L-1β及TNF-α水平低于模型組，提示消朦靈方能夠有效降低糖尿病大鼠視網膜病變大鼠IL-6、VEGF、1L-1β及TNF-α水平，降低炎癥反應，可減少高血糖對視網膜的損害。

Ang-1是形成成熟血管所必需的，其與內皮特異性受體酪氨酸激酶2結合發揮作用，致使內皮細胞通透性降低，對VEGF具有調節作用，維持內皮細胞穩態。VEGF是糖尿病視網膜病變發生的重要因素，可使血管通透性增加，導致血-視網膜屏障功能破壞，致視網膜血管滲漏，且對視網膜內皮細胞的增殖及遷移具有刺激作用，誘發視網膜內形成新生血管，損害視功能[13]。在糖尿病視網膜病變中VEGF/VEGFR2發揮了重要作用，VEGF與VEGFR2的高親和力結合并誘導VEGFR2的磷酸化而發揮促血管生成活性；對VEGF-VEGFR2及其下游ERK1/2和p38信號通路進行阻斷，對視網膜內皮細胞血管具有抑制作用[14-15]。本研究結果顯示，治療后高劑量組、空白組Ang-1、VEGF、VEGFR2蛋白及mRNA表達水平均低于中劑量組、低劑量組及模型組，中劑量組Ang-1、VEGF、VEGFR2蛋白及mRNA表達水平均低于低劑量組及模型組，低劑量組Ang-1、VEGF、VEGFR2蛋白及mRNA表達水平低于模型組，提示消朦靈方能夠有效降低糖尿病大鼠視網膜病變Ang-1、VEGF、VEGFR2蛋白及mRNA表達水平，改善糖尿病大鼠視網膜病變的嚴重程度，能夠促使視網膜各層組織、毛細血管恢復。這可能是由于黨參具有抗炎、抗氧化、調節糖脂代謝、免疫調節及抗腫瘤等作用[16]。毛冬青具有抗壓、抗菌、抗血小板聚集、抗血栓、抗凝及對腦組織缺血、缺氧損傷的保護等多方面的作用[17]。麥冬具有降血糖、抗腫瘤、抗心肌缺血、免疫、抗氧化、抗過敏、保護外分泌腺等方面的藥理作用[18]。五味子具有抗腫瘤、保護肝臟、降糖、延緩衰老、抗菌抑菌、增強骨骼肌、中樞調節、抗疲勞與耐缺氧、改善泌尿生殖與心血管系統、免疫調節等方面藥理作用[19]。田七具有止血、抗血小板聚集、抗心律失常、保護腦組織、降血壓、降血脂、抗炎、保肝、護腎、抗腫瘤、免疫調節等多方面的藥理作用[20]。

本研究進一步分析了消朦靈方對糖尿病視網膜病變大鼠的細胞凋亡情況及視網膜組織光學顯微鏡下結構變化情況，結果顯示，治療后，高劑量組、空白組細胞凋亡指數均低于中劑量組、低劑量組及模型組，中劑量組細胞凋亡指數低于低劑量組及模型組，低劑量組細胞凋亡指數低于模型組；高劑量組細胞凋亡指數高于空白組，提示消朦靈方能夠降低糖尿病大鼠視網膜病變細胞凋亡指數。

綜上所述，消朦靈方能夠有效降低糖尿病大鼠視網膜病變血糖水平，降低炎癥水平，下調Ang-1、VEGF、VEGFR2水平，減少高血糖對視網膜的損害，降低細胞凋亡指數，促使視網膜各層組織、毛細血管恢復正常。