四種中藥不同藥性與藥理作用關系研究

安 娜,黃芳敏，王健輝，沈 偉

(1.西安市第一醫院 西北大學附屬第一醫院 陜西省眼科研究所 陜西省眼科學重點實驗室陜西省眼科疾病臨床醫學研究中心，陜西 西安 710002；2.陜西省新藥審評中心，陜西 西安 710065)

中藥藥性與性能是闡釋中藥作用和指導中醫臨床用藥的重要依據,概括歸納為四氣、五味、歸經、升降浮沉等內容,溫、熱、寒、涼四種藥性是中藥藥性理論的重要組成部分[1-3]。藥性體系中的各種性能，主要依據藥物作用于機體所產生的效應和針對臨床病證用藥的實際療效總結出來，其認識先于功效，是對功效的一種高度概括[4-5]。藥性一致的每一味中藥對機體生理狀態所產生的效應是存有差異的[6],如何準確地推理與標識中藥藥性的實質內涵并賦予藥理學理論意義，這對傳統中藥藥性理論的重新升華具有重要意義。本文根據四種中藥藥性對肝郁脾虛小鼠和細胞內信號通路蛋白表達的影響，探討中藥藥性體系對藥理學理論的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 昆明種小白鼠，體重18～22 g，由四醫大動物中心提供，細胞來源：肝星狀細胞系HSC-T6(長沙萬百生物技術)。

1.2 試劑耗材 四氯化碳(CCl4，天津試劑二廠，批號：20060912)；轉化生長因子-β1(transforming growth factor，TGF-β1，美國羅氏，貨號：H14406)；MEK抑制劑PD98059(美國Promega，貨號：41539903)；丙氨酸氨基轉移酶試劑盒(Alanine Aminotransferase Kit，ALT，批號：090521)、膽堿酯酶試劑盒(Cholinesterase，CHE，批號080751)、谷胱甘肽試劑盒(Glutathione， GSH ,批號：090637)(中生北控生物)；α-Smooth Muscle Actin(D4K9N) XP Rabbit mAb #19245；Anti-p-ERK1/2，批號：G2508；Anti-ERK1/2，批號：C1307；Anti-TGF-β receptor typeⅠ，TβRⅠ，批號：D2407、Anti -TGF-β receptor type Ⅱ，TβRⅡ，批號：D1107；辣根過氧化物酶標記山羊抗大鼠IgG(H+L)(A0192 碧云天)；Rabbit Anti-Ⅰ型膠原(CollagenTypeⅠ，COL-Ⅰ，批號：#I1906)；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(A0208 碧云天)；Rabbit Anti-Smad2/3(Boster，批號：080710)；BeyoECL Moon(極超敏ECL化學發光試劑盒，批號：P0018FS 碧云天)、PVDF膜(No：FFP24 碧云天)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(No：P0012S碧云天)、RIPA裂解液(No：P0013 碧云天)。

1.3 藥物劑量與分組設計 柴胡提取物每克稠膏含生藥7.69 g；丹參提取物每克稠膏含生藥2.50 g；五味子提取物每克稠膏含生藥2.24 g；靈芝提取物每克稠膏含生藥10.24 g；體內試驗分六組：對照組、CCl4組、柴胡組、五味子組、丹參組、靈芝組，體內給藥劑量參照2010版《中國藥典》一部均為10 g生藥/kg；體外試驗分十二組：對照組、TGF-β1組、PD98059阻斷劑組(100 μmol/L)、PD98059+TGF-β1組，各藥物劑量依據MTT法測定IC50濃度100 mg/L。

1.4 體內實驗 取90只正常雄性昆明種小白鼠，于適應環境3 d后開始進行試驗，將其隨機分為九組，每組10只小鼠，正常組在皮下注射0.9%氯化鈉，注射量為2 ml/kg(小鼠體重比)，其余分組均在小鼠皮下注射 20% CCl4的香油溶液制備肝郁脾虛模型[7]，注射量為2 ml/kg(小鼠體重比)，每隔3 d注射1次，共3次，期間以高脂低蛋白飼料飼養并飲用10%乙醇溶液，于末次注射后次日開始，正常組、模型組小鼠灌胃蒸餾水10 ml/kg，柴胡組小鼠給予柴胡提取物1.3 g/kg，丹參組小鼠給予丹參提取物4.0 g/kg，五味子組小鼠給予五味子提取物4.5 g/kg，靈芝組小鼠給予靈芝提取物0.97 g/kg，連續給藥10 d；同時各試驗組小鼠同法同時給予注射CCl4溶液2 ml/kg，正常組皮下注射0.9%氯化鈉，末次給藥后小鼠禁食給水，12 h后眼眶采血、離心后取血清進行測定。

1.5 細胞培養及蛋白樣品制備 HSC-T6細胞傳代步驟參考文獻操作[8]。接種HSC-T6細胞于培養瓶中，待細胞生長至約70%時，將細胞培養瓶分別命名為八組，依次為：對照組、TGF-β1組、PD98059(PD)組、PD98059+TGF-β1(PT)組、五味子組、丹參組、柴胡組、靈芝組。對照組與TGF-β1組分別加正常培養液，其余組分別加對應的藥物提取物溶液0.1 g/L，繼續培養24 h。除對照組和PD組外，其余各組于試驗結束前12 h時加入TGF-β1溶液(10 μg/L)至試驗結束。棄去培養上清后，培養瓶中加PBS，洗滌2次，棄除PBS后加入適量RIPA裂解液，4 ℃靜置10 min后，吸取瓶內液體于EP管中，4 ℃條件下12000 r/min離心10 min、對各樣品進行BCA定量。

1.6 Western blotting檢測 調整上樣量為35 μg/well，電泳和轉膜參考高宇勤等操作進行[9]，電泳完采用10%脫脂奶粉進行封閉，分別用α-SMA、COL-Ⅰ、ERK、p-ERK、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3一抗進行孵育(稀釋比例為1∶1000)，4 ℃過夜后，加入HRP耦連的二抗進行孵育(稀釋比例為1∶3000)，顯影后計算表達量：蛋白表達量=試驗組目的蛋白表達灰度值/TGF-β1組目的蛋白表達灰度值，TGF-β1組表達量記為1。

1.7 統計學方法 數據采用SPSS 9.0統計學軟件進行分析，采用最小顯著差異法(LSD)，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 四味中藥對CCl4所致肝郁脾虛小鼠酶活性的作用 對CCl4小鼠肝郁脾虛模型，柴胡提取物明顯降低肝郁脾虛小鼠血清和肝勻漿ALT、ALP酶活性和MDA，反映肝功能蛋白合成的CHE和GSH增加；丹參提取物明顯降低小鼠血清和肝勻漿ALT、ALP酶活性和MDA，CHE和GSH含量增加。五味子提取物明顯降低小鼠血清和肝勻漿ALT、ALP酶活性和MDA，反映肝功能蛋白合成的CHE和GSH增加。靈芝提取物增加小鼠血清和肝勻漿ALT、ALP酶活性，CHE和GSH含量增加，明顯降低MDA含量。見表1。

表1 四味中藥對CCl4所致慢性肝損傷小鼠酶活性與自由基的影響

2.2 四味中藥對TGF-β1誘導HSC-T6表達COL-Ⅰ、α-SMA蛋白的作用 TGF-β1誘導HSC-T6表達COL-Ⅰ、α-SMA明顯增加，與對照組比較有統計學差異(P<0.05)。PD組與PT組能明顯降低TGF-β1誘導的HSC-T6表達COL-Ⅰ，與TGF-β1組比較，有統計學差異(P<0.05)，苦、寒柴胡或苦、微寒丹參，藥性酸、甘、溫的五味子，藥性甘，平靈芝作用結果見圖1。

a：對照組；b：TGF-β1組；c：PD組；d：PD+TGF-β1組；e：五味子組；f：丹參組；g：柴胡組；h：靈芝組。

2.3 四味中藥對TGF-β1誘導HSC-T6表達Ras、ERK、p-ERK蛋白的作用 TGF-β1誘導HSC-T6表達 Ras、ERK、p-ERK顯著上調，與對照組比較，有統計學差異(P<0.05)；PD98059能明顯下調HSC-T6表達Ras，與TGF-β1組比較，有統計學差異(P<0.05)，但對TGF-β1誘導HSC-T6表達Ras無影響；PD98059能明顯下調TGF-β1誘導HSC-T6表達ERK、p-ERK(P<0.05)。苦、寒柴胡或苦、微寒丹參，藥性酸、甘、溫的五味子，藥性甘，平靈芝作用結果見圖2。

a：對照組；b：TGF-β1組；c：PD組；d：PD+ TGF-β1組；e：五味子組；f：丹參組；g：柴胡組；h：靈芝組。

2.4 四味中藥對TGF-β1誘導HSC-T6表達TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3的作用 TGF-β1誘導HSC-T6表達TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3明顯上調，與對照組比較，有統計學差異(P<0.05)；PD組與PT組TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3表達量明顯下調，與TGF-β1組比較，有統計學差異(P<0.05)；苦、寒柴胡或苦、微寒丹參，藥性酸、甘、溫的五味子，藥性甘，平靈芝作用結果見圖3。

a：對照組；b：TGF-β1組；c：PD組；d：PD+TGF-β1組 ；e：五味子組；f：丹參組；g：柴胡組；h：靈芝組。

3 討 論

古代醫學認為氣是構成萬物的本源[10]，中醫學認為任何疾病的發生發展過程都是致病因素(邪氣)作用于人體，引起機體正邪斗爭，導致陰陽氣血偏盛偏衰或臟腑經絡機能活動失常的結果[11]。中藥藥性是中藥基本理論的核心,而升降浮沉為中藥藥性內容之一[12]，中藥之所以能夠治愈疾病就是因為中藥具有藥性和性能的屬性，四氣是中藥藥性論的核心部分，即藥物具有寒、熱、溫、涼。藥性之寒涼屬陰，溫熱屬陽，以藥性之寒熱來糾正疾病表現出來的陰陽偏盛偏衰，寒涼藥治療熱證，驅寒、溫里、助陽藥物治療寒證的正治治療原則[13]，“廣義”和“狹義”的藥性均將四氣、五味、升降沉浮等歸入其范疇[14]。中藥藥性理論研究一直缺乏現代科學的闡述。本實驗假設中藥藥性與其所含有效成分應滿足一定的含量關系，則藥性存在，否則藥性會減弱甚至完全消失[15]。在我們以往實驗中發現小鼠皮下注射CCl4引起的肝郁脾虛小鼠模型和TGFβ1誘導HSC-T6活化細胞模型，通過對模型相關指標的影響來探討苦、寒柴胡，苦、微寒丹參，藥性酸、甘、溫的五味子，藥性甘、平靈芝的作用。小鼠體內使用劑量均為10 g/kg(生藥計)。體外細胞使用劑量依據是依據受試藥物IC50來確定。整體試驗顯示藥性苦、寒柴胡和苦、微寒丹參能對抗CCl4導致小鼠肝郁脾虛證，減輕肝細胞變性，促進肝細胞再生，恢復肝功能,抑制肝纖維組織增生確有一定生物效應。柴胡與丹參是兩種不同的植物藥，若中醫藥性論來分屬性，兩種屬于苦、寒和苦、微寒藥，在改善肝臟酶譜學指標苦寒屬性柴胡和苦、微寒屬性丹參沒有質的區別。藥性酸、甘、溫五味子入肝經，在改善肝臟酶譜學上同樣具有相同的作用效應，但藥性與前二者不同，卻有改善肝臟酶譜學指標效應，與藥性論不同。而藥性甘、平，靈芝除具有提高GSH清除自由基作用外,且無苦、寒藥柴胡和苦、微寒藥丹參上述作用，這與靈芝藥性甘、平相吻。

生命基礎物質是細胞，細胞膜上受體接受外部信號激動或靜默細胞器活動。本實驗選擇的肝星狀細胞是肝臟細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)的主要來源，肝星狀細胞的激活對肝郁脾虛的發生、發展起著關鍵作用，而TGF-β1是導致HSC活化的關鍵細胞因子之一[16-17]，HSC通過激活Ras/ERK信號通路進一步導致Smad2、Smad3連接部位磷酸化，促進Smad3和Smad4復合體形成及轉位入核，進而促進膠原的生成，干預ERK信號通路，可降低肝臟內膠原合成[18]。本實驗采用TGF-β1誘導HSC-T6表達ERK和Smad信號通路蛋白，以ERK阻斷劑PD98059為陽性對照，在細胞水平上探討4味中藥藥性差異對HSC-T6信號通路蛋白表達所產生的影響。試驗顯示TGF-β1誘導HSC-T6表達Ras/ERK通路蛋白Ras、ERK、p-ERK明顯增加，HSC-T6表達COL-Ⅰ含量平行性增加。PD98059(一種ERK磷酸化抑制劑)能顯著降低HSC-T6表達Ras、ERK、p-ERK，不能拮抗TGF-β1誘導HSC-T6表達Ras、ERK，但可阻斷TGF-β1誘導HSC-T6表達p-ERK，蛋白質的磷酸化才有可能具有激動蛋白信號的信號傳導機制，HSC內p-ERK下降，COL-Ⅰ表達平行性降低，提示PD阻斷Ras/ERK通路而降低COL-Ⅰ轉錄與合成。藥性苦、寒柴胡和苦、微寒丹參對HSC-T6表達Ras、ERK無影響，但可明顯降低p-ERK水平，同時COL-Ⅰ表達下降，顯示苦、寒藥和苦、微寒藥具有抑制Ras/ERK通路中ERK磷酸化而降低COL-Ⅰ轉錄與合成。藥性酸、甘、溫的五味子提高HSC-T6表達Ras水平，可降低ERK和p-ERK水平而抑制COL-Ⅰ轉錄與合成，藥性平、甘的靈芝提高HSC-T6內Ras和p-ERK表達水平。Ras是激活ERK蛋白而細胞激活，這與靈芝平、甘藥性有關。試驗顯示TGF-β激活HSC-T6活化，其活化標志物α-SMA表達增加。TGF-β1/Smad通路蛋白TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3表達增加。在TGF-β1/Smad信號傳導通路中，TGF-β1先與TβRⅡ結合，形成的復合物再與TβRⅠ結合，磷酸化的Smad2、Smad3與Smad4形成異聚體復合物積聚核內選擇性地促進靶基因轉錄[19-20]。試驗發現ERK抑制劑PD可顯著抑制HSC-T6和受TGF-β1激活的HSC-T6表達TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3增加，提示PD對TGFβ1/Smad信號通路有抑制作用。PD的這種作用提示在HSC-T6內ERK與Smad信號傳遞途徑存在相互調節，進而導致Smad2與 Smad3連接部位的磷酸化，最終促進Smad4和Smad3復合物形成及轉化入核發揮HSC-T6活化COL-Ⅰ轉錄與合成的作用。試驗顯示藥性苦、寒柴胡和苦、微寒丹參對TGF-β1激活HSC表達TβRⅠ、TβRⅡ和Smad有明顯下調作用，兩者無質的差異。藥性酸、甘、溫五味子對TGF-β1激活HSC表達TβRⅠ和Smad有明顯下調作用，對TβRⅡ表達無影響。藥性甘、平靈芝對TGF-β1激活HSC表達TβRⅠ、TβRⅡ和Smad有明顯下調作用。試驗結果顯示藥性苦、寒柴胡和苦、微寒丹參其化學成分完全不同，卻產生相似抑制肝郁脾虛的作用，干預靶細胞內COL-Ⅰ轉錄與合成，其干預機制一致，藥性酸、甘、溫五味子與前二者藥性不同而對TβRⅡ表達無作用，TβRⅡ是信號傳遞過程中關鍵蛋白， 顯示五味子對TGF-β1/Smad信號通路作用不甚明顯。藥性甘、平靈芝出現與苦、寒相反的作用機制。本試驗依據中藥藥性描述探討影響機體生理變化和靶細胞內信號蛋白表達的意義，中藥藥性可宏觀地反映藥理作用關系，依據中藥藥性的描述，通過研究影響機體生理變化和靶細胞內信號蛋白表達的意義，探討不同藥性的藥理學作用機制，辨證地為廣義的中藥藥性賦予了藥理學科學內涵。中藥藥性是中醫臨床治療疾病的原則，不同藥性對機體生理效應不同，在中醫臨床實踐中有一定的指導意義。