燈盞花素對非小細胞肺癌A549細胞的作用及機制研究

劉 婷，李 洋，石志紅

(1.西安交通大學第一附屬醫院涉外病房，陜西 西安 710061；2.西安交通大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，陜西 西安 710061)

肺癌是高發病率與高死亡率的惡性腫瘤之一，被診斷為非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)患者比例約占80%[1]。多數NSCLC患者被確診時已經發展為NSCLC晚期，臨床上所采用放化療、免疫治療或者靶向藥物治療，雖然能夠讓部分患者的生存時間延長，但是大部分患者預后仍舊不理想[2-3]。燈盞花別名地頂草或東菊，《云南中草藥》中記載燈盞花甘、性溫，具有散寒解表、止痛和舒筋等功效，可用于跌打損傷、瘧疾、腦血栓形成、腦出血和風濕痛等疾病治療[4]。燈盞花素(Breviscapine,BVP)是燈盞花的主要提取成分之一，在抗炎癥反應、抗氧化應激、抑制血小板聚集以及調節機體微循環系統具有重要作用。既往研究[5-6]顯示BVP在胃癌、前列腺癌、肝癌等惡性腫瘤表現出顯著的抗腫瘤作用。也有學者提出BVP在肺癌中存在作用[7]，但是其中的具體作用機制尚不清楚。本文通過不同濃度BVP處理非小細胞肺癌A549細胞來探索BVPA549細胞的增殖及凋亡的影響，為臨床治療NSCLC方案選擇提供試驗參考意見。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料 儀器：CO2細胞培養箱(Heraeus)，96孔板、12孔板、6孔板(Thermo Fisher Scientific)，超低溫冰箱(Thermo Scientific)，多功能酶標儀(Thermo Electron)、流式細胞儀(Becton Dikinson)，紫外分光光度計(讓奇儀器科技有限公司)，切片機(萊卡)，高速離心機(Thermo)。試劑：BVP(南京藥業有限公司)，兔抗人增殖細胞核抗原(PCNA)、Ki67、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、天冬氨酸蛋白水解酶-9(Caspase-9)、天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、p21抗體購于北京博奧森生物技術有限公司，二甲亞砜、MTT(Sigma)。材料：非小細胞肺癌A549細胞，購于上海一研究生物科技有限公司。

1.2 細胞培養及處理方法 將非小細胞肺癌A549細胞置于含有青霉素、鏈霉素各100 U/ml的完全培養基中，于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下靜止培養。A549細胞生長至90%時則進行傳代，制成細胞懸液。

1.3 MTT法檢測細胞增殖情況 取對數生長期的非小細胞肺癌A549細胞于超凈臺中制成2×104/ml的細胞懸液，接種在96孔板中，200 μl/孔，37 ℃、5% CO2培養箱中培養12 h后，將A549細胞分為對照組、BVP低劑量組(20 μmol/L)、BVP中劑量組(40 μmol/L)、BVP高劑量組(80 μmol/L)，每組6個重復孔，低劑量組、中劑量組、高劑量組均加入BVP，并使其最終濃度分別為20、40、80 μmol/L，對照組加入等劑量的DMSO。各組細胞在培養12、24、48 h后棄培養液，加20 μl的MTT溶液，培養2 h，棄MTT溶液，加入150 μl DMSO，采用酶標儀在490 nm波長處檢測吸光度值，細胞存活率=處理組OD值/對照組OD值×100%。

1.4 細胞凋亡檢測 取1.3中BVP處理24 h細胞，1000 r/min離心5 min，收集細胞沉淀，然后加入300 μl緩沖液重懸細胞，加入5 μl Annexin V/FITC、10 μl PI混合均勻，室溫避光孵育15 min，上樣流式細胞儀。

1.5 Western-blot檢測 提取各1.3中BVP處理24 h細胞總蛋白，經SDS-PAGE凝膠電泳、電轉膜至PVDF膜，密封1 h，加入Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax、Ki67、PCNA、CyclinD1、p21一抗(1∶500)4 ℃孵育過夜，采用TBST漂洗PVDF膜40 min，加入HRP標記的二抗(1∶500)孵育1.5 h，參照ECL試劑盒操作說明進行顯影與定影，觀察膜上蛋白條帶，收集影像。

2 結 果

2.1 燈盞花素對A549細胞增殖的影響 見表1。在處理時間相同時，A549細胞存活率隨著BVP濃度的增加而降低；在相同BVP濃度處理下，A549細胞存活率隨著BVP作用時間的延長而降低(P<0.05)。

表1 各組細胞存活率比較(%)

2.2 燈盞花素對細胞增殖相關蛋白水平的影響 見表2。BVP低劑量組、BVP中劑量組和BVP高劑量組細胞的Ki67、PCNA、Cyclin D1蛋白表達量低于對照組(P<0.05)，p21表達量高于對照組(P<0.05)，存在劑量效應(P<0.05)。

表2 各組細胞增殖相關蛋白水平比較

2.3 燈盞花素對A549細胞凋亡的影響 見表3。BVP低劑量組、BVP中劑量組和BVP高劑量組細胞的凋亡率均高于對照組(P<0.05)，存在劑量效應(P<0.05)；BVP低劑量組、BVP中劑量組和BVP高劑量組Bax、Caspase-9與Caspase-3蛋白水平高于對照組(P<0.05)，而Bcl-2蛋白水平低于對照組(P<0.05)，存在劑量效應。

表3 各組細胞凋亡率及相關蛋白水平比較

3 討 論

非小細胞肺癌屬于一種肺部惡性腫瘤性疾病，發病起源于支氣管黏膜、支氣管腺體和肺泡上皮，顯微鏡下核異形、細胞變大和胞漿豐富等特點[8]。我國非小細胞肺癌病例占據肺癌四成以上，早發現、早診斷和早治療對提高肺癌患者的治愈率及5年生存率至關重要。目前非小細胞肺癌主要治療方式有手術、化療、放療、局部介入治療、分子靶向治療以及中醫中藥治療等[9]，雖然放化療方式可以使部分患者病情得到改善，但是長期化療、放療對患者機體仍可產生不可忽視的不良反應，不利于患者自身免疫力提高，并可能逐漸出現腫瘤耐藥。中醫中藥在惡性腫瘤治療過程的不良反應少的優勢已逐漸受到大眾認可[10]，BVP是燈盞花中的黃酮類成分，其包括燈盞甲素與燈盞乙素，臨床上主要將BVP用于治療高血壓、腦血管缺血、心血管等疾病并且臨床療效較好。此外，動物體內體外實驗研究顯示BVP具有心血管藥物的作用，例如抗血小板聚集、抗凝血、抗血栓形成、增強機體清除自由基能力以及改善機體微循環的作用。近年研究顯示BVP在腫瘤生長與腫瘤細胞的生物學行為方面具有一定的抑制作用。Ke等[11]研究報道顯示，BVP能夠降低肝癌細胞的侵襲與遷移能力，主要是通過抑制STAT3/AKT信號通路實現的。

本研究結果顯示，BVP能夠降低A549細胞的存活率且存在劑量效應，采取Western-blot檢測與細胞增殖相關蛋白表達水平，結果顯示BVP能夠降低A549細胞中的Ki67、PCNA、Cyclin D1蛋白含量，并且增加p21蛋白水平。Cyclin D1能夠與細胞周期依賴性激酶(CDK)結合參與細胞周期，其可以在G1期迅速合成，在進入S期時開始降解[12]。PCNA是一種促進DNA延伸的核蛋白，在真核生物細胞中的DNA復制具有重要作用[13]。Ki-67是一種增殖細胞核抗原，能夠反映細胞增殖情況，當細胞進入S期時其蛋白含量增加[14-15]。在細胞增殖的過程中除了周期蛋白、增殖細胞核抗原的參與，還存在一類細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI)參與細胞增殖過程。CKI能夠與CDK結合并抑制CDK活性，來保證細胞周期的高度時序性，因此CKI在細胞增殖、細胞周期中起著負調控作用。p21是CKI家族成員之一，它能與PNCA結合來實現對DNA合成的抑制作用[16]。Guan等[17]研究結果顯示BVP可以誘導前列腺癌細胞的DNA損傷，進而實現對腫瘤細胞的生長的抑制作用與促進腫瘤細胞的凋亡作用。本研究結果與前人結果的趨勢相似，提示BVP可能是通過增加p21蛋白水平，使p21與PNCA結合增加而抑制DNA合成；同時還可能增加CKI與CDK結合，抑制CDK的活性以致Cyclin D1/CDK結合受到影響，不能使A549細胞快速從G1期到S期的轉換，從而降低Ki-67蛋白含量，阻滯了A549細胞周期，延緩了細胞分裂進程，最終影響到非小細胞肺癌A549細胞的增殖。

細胞凋亡在細胞的生物學進程中具有重要意義，細胞存活率的降低不僅細胞增殖能力降低，還存在細胞凋亡率增加的可能。本研究結果顯示BVP能夠增加非小細胞肺癌A549細胞的細胞凋亡率，同時與細胞凋亡相關蛋白的Western-blot檢測顯示Bax、Caspase-3、Caspase-9的蛋白含量增加，而Bcl-2蛋白水平降低。Bax是促凋亡基因，而Bcl-2是抗凋亡基因，Bax、Bcl-2拮抗調控細胞凋亡，Bax、Bcl-2比例情況決定著細胞凋亡狀態[18-20]。Caspase-3是各種凋亡途徑的靶蛋白，凋亡途徑中的信號被激活后，會促使Caspase蛋白家族表達水平發生改變，經Caspase-3蛋白誘導細胞凋亡[21]。Bax是線粒體膜的成分之一，其含量增加能夠使Cyt-C穿過線粒體膜進入細胞基質，激活細胞凋亡程序起始的Caspase-9，進而激活Caspase-3，促使細胞凋亡[22]。孫蕾等[23]研究顯示BVP可以通過上調Bax表達，下調Bcl-2表達來增加A549細胞凋亡。本研究結果與前人研究相似，表明BVP可能是通過增加Bax蛋白水平，降低Bcl-2蛋白含量，激活Caspase-9、Caspase-3活性，進而促進A549細胞凋亡。

綜上所述，BVP可以通過上調p21蛋白表達量，下調PNCA、CyclinD1、Ki-67蛋白含量，阻滯細胞周期，從而使細胞增殖受到抑制；BVP可以通過增加Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白水平，降低Bcl-2含量，從而促進A549細胞凋亡。但是BVP是通過何種途徑調節非小細胞肺癌A549細胞增殖、凋亡的詳細機制還需要更深層次研究。